基因工程-目的基因的获取PPT.ppt

;第四章 目的基因的获取;第四章 目的基因的获取;;;第一节 基因组DNA片断化;第一节 基因组DNA片断化;由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。;二、随机片断化;1）4bp的内切酶;2. 机械切割法;第二节 化学合成目的基因;第二节 化学合成目的基因;① 保护dNTP的5’端-OH 或3’端P;（2）合成过程;原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。;固相磷酸三酯合成过程;化学合成的DNA片断一般在200bp以内。;T4 DNA连接酶;2. 互补延伸连接法;1. 直接合成基因;化学合成法获取目的基因;;DNA合成仪;第三节 目的基因的保存和扩增; 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。;（2）目前常用??载体 ;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。;（2）载体与基因组DNA大片段的连接;各种酶的接头可以向公司定做或购买。;;限制酶切位点;酵母人工染色体基因组文库的构建;4. 基因组文库的大小;例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104 bp;1. cDNA;（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。;4. 构建cDNA文库的一般步骤;4. 构建cDNA文库的一般步骤;分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 ;Oligo dT纤维柱层析法;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。;④去掉发卡结构;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。;mRNA;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;;;6. cDNA文库的大小; 基因组DNA克隆 cDNA克隆;三、文库的查询（screening）;第四节 目的基因的分离和扩增;第四节 目的基因的分离和扩增;纤 维 柱;2. mRNA消解杂交;从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。;A;3. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）;（2）12种锚定引物;（3）5’端的随机引物;（4）随机引物与锚定引物成对扩增;（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较;二、PCR扩增获得目的基因;原核基因组部分;（1）提取基因组 total RNA;目的基因 的引物1