定量组织化学和组织化学的应用PPT.pptVIP

流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：千、万细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流式细胞仪的工作原理 光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 荧光信号 荧光染料被激发而发射的光信号 荧光信号大小 被标记组分含量的定量 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量 流式细胞仪产生的信号 流式细胞仪产生的信号 非荧光信号 颗粒度 细胞大小 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉。 细胞分选的原理 流式细胞仪分选系统 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 细胞分选系统 流式细胞仪的测量对象 对象类型 细胞类型：高等真核细胞；酵母；细菌； 非生命颗粒：细胞核、染色体和其它细胞器以及乳化微球等。 流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例 1）不需染色： 大小，胞浆颗粒度，细胞自发荧光，色素，细胞精确计数。 2）需染色或标记： 细胞组分： 细胞膜：流动性，通透性，膜电位 细胞内离子：H+（可检测PH值），Na+，K+，Ca2+（结合的和自由的）。 核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等 总蛋白质、蛋白质分子间相互作用、抗原、细胞骨架成分、受体 流式细胞仪的样品要求 1、单细胞悬液 2、被检细胞或颗粒大小0.2－300um 3、样品中至少20000个细胞，浓度105-107 个/毫升 注意：不要离心次数太多 定量组织化学 掌握内容 常用的定量细胞化学技术种类 图像分析系统、显微分光光度技术、流式细胞仪技术和激光扫描共聚焦技术在定量组织化学中的应用 概 述 组织化学的建立，开始只能对组织细胞内的化学成分进行定性、定位观察。 大量的组织细胞图像，限于人眼分辨率和定性描述的局限性，只能用文字定性的、半定量的或数据或曲线来部分地描述有关信息。 概 述 多学科技术的综合应用，如计算机、红外线、超声波、放射性核素、光纤、电视、光学和电子显微镜、磁共振、激光等，使组织化学研究上升到定量分析分子和离子的水平。 常用的定量组化手段 1、目测术——半定量技术 2、图象分析仪：测量细胞的几何参数、灰度参数、色度参数、纹理参数和细胞化学反应的光密度参数等。形态立体学技术测量计算细胞的三维形态参数。（细胞形态计量学技术） 4、X射线微区分析测定细胞内元素或细胞化学反应产物的元素类型和含量。 5、用特殊显微镜检术进行细胞形态、细胞内成分定量测定（显微偏光技术、显微干涉技术、激光扫描共聚焦技术） 一、目测定量术 细胞计数 酶组化、免疫组化及荧光组化的初步定量描述法——阳性率和阳性强度法 共五级描述，从“－”到“＋＋＋＋” 二、图像分析系统 采用计算机技术和数学形态学方法客观精确地用数据表达细胞图象中的各种信息 按采用的计算机不同，可分为大型、中型、小型图像分析仪，医学图象处理大都采用后者。按显示的图象不同又可分为黑白、伪彩色和真彩色图像分析仪。 （显微镜）、图像输入装置、信息专用计算机、输出设备 基本原理 把光学图像成像于摄像管的靶面上，再把摄像管的靶面上的光学图像变换成电荷浓淡表示的图像 光学信号——电子信号——模拟成像 在显微图像中的细胞或细胞器，一般具有图像的三个要素： ①浓度信息 ②位置信息 ③色彩信息 浓度信息作为图像中重要的一种信息，度量它的尺度称为灰度，它代表图像各部分颜色的深强程度。 灰度共有256级 ，0为黑色，255为白色 人眼判断图象浓淡时，灰度分辨率大约在20灰度级以下 位置信息是指在一幅图象平面上建立坐标系，用X和Y表示图象中任一象素点的二维平面位置 而函数形式f(x,y)表示位置为(x，y)那一像素点上的灰度。 人眼对彩色的分辨能力大大高于对黑白图象灰度级的观察。 因此，在图像分析中．常常使用不同的彩色和色调的变