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DAPK基因启动子区过甲基化与颈段食管癌关系 　　【摘要】目的 探讨死亡相关蛋白激酶基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系。方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）法和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分析颈段食管部正常黏膜、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况。结果 42例颈段食管癌组织中，有27例(64.3%)DAPK基因启动子区过甲基化，其在各病理分级和T分级之间差异无统计学意义（P0.05），而在N分级之间差异有统计学意义（P 　　【关键词】颈段食管肿瘤；蛋白激酶类/遗传学；基因表达；DNA甲基化 　　死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种钙离子和钙调素依赖的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，它参与干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、Fas等诱导的细胞凋亡过程，具有促进凋亡的功能［1］。DAPK的正常表达可抑制肿瘤的发生、发展和转移。有研究发现，在一些恶性细胞株??肿瘤组织中，DAPK表达缺失或极少表达，可能与其基因启动子区CpG岛过甲基化有关。为探讨抑癌基因DAPK启动子区CpG岛过甲基化与颈段食管癌的关系，笔者观察了颈段食管部正常组织、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达情况。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 42例颈段食管癌及相应癌旁组织来源于笔者所在医院手术切除的标本，25例癌旁组织取自肿瘤边缘5 mm外区域，为肉眼下正常组织，且病理检查未见癌细胞浸润。5例颈段食管部正常组织来自颈段食管外伤手术修复的患者。颈段食管部组织切除后，立即放入－70 ℃冰箱中备用。42例颈段食管癌患者中，男34例，女8例。年龄最小者32岁，最大者78岁，平均53.4岁。术前均未经化疗或放疗。全部颈段食管癌组织经病理诊断均为鳞状细胞癌，其中高分化17例，中分化10例，低分化15例。按1997年国际抗癌协会TNM标准，T1期7例，T2期9例，T3期15例，T4期11例，N0期29例，N1期13例。 　　1.2 主要试剂及仪器 基因组DNA修饰试剂盒购于美国Intergen公司；TRIzol试剂购于GIBCO公司；逆转录酶MLV为Promega公司产品。PCR仪为9600型，成像系统为Grab-it 4.0，分析软件为Gelworks 1 D interdiate。 　　1.3 方法 　　1.3.1 DNA提取和亚硫酸氢钠修饰 DNA提取用酚氯仿抽提法。取1 μg DNA，用基因组DNA修饰试剂进行修饰。 　　1.3.2 甲基化特异性PCR DAPK基因的扩增用甲基化特异性PCR（MSP）法。甲基化引物：5-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3 (上游)，5-CCC TCC CAA ACG CCG-3（下游）；非甲基化引物：5-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3（上游），5-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3（下游）。反应条件为：95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环后，72 ℃、5 min。反应体系（25 μl）含模板约0.1 μg、0.4 μmol各引物、0.2 mmol dNTP、10 mmol 2-巯基乙醇、Mg2+ 1.5 mmol、1.0 UTaqDNA聚合酶、10×反应缓冲液2.5 μl（含硫酸氨）和适量水。为保证检测的可靠性，以正常人外周血淋巴细胞DNA，经SssI甲基转移酶处理过的胎盘DNA和水，分别做非甲基化与甲基化的阳性对照和空白对照。取10 μl PCR扩增产物用3％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。 　　RNA提取及RT-PCR检测mRNA：取－70 ℃存放的上述组织，每份约50 mg，用1 ml TRIzol（按说明书操作）逐步提取总RNA。CDNA第一链合成体系为25 U，每份取总RNA 2 μg，用逆转录酶MLV、oligodT以及相关试剂按说明配成适当浓度，合成cDNA。 　　根据GenBank中DAPK mRNA序列，用primer premier 5.0设计引物：5-GCC TGG AGA CGG AGA AGA T-3(上游)，5 -AAG TCC CGT GGC TGG TAG A-3（下游），内参照－actin的引物：5-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3（上游），5-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3（下游）。为了确保内参和目的基因的可比性，用primer dropping法（6）进行PCR扩增，即在扩增前先找出各自的平台期，使反应终止于平台期之前的指数增长期。PCR