E.coli DH10B碱性磷酸酶基因克隆、表达及活性研究.docVIP

E.coli DH10B碱性磷酸酶基因克隆、表达及活性研究 　　[摘要] 目的：克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm）， 为AKP的定向改构及应用奠定基础。方法：采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm；将phoAm克隆入表达载体pET28a，再转入E.coli BL21（DE3）进行表达；用免疫金层析法和SDS法检测表达的重组rAKP；采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。结果：rAKP单体分子量约47 K，活性分析比对照菌提高21.5倍。结论：获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP。 　　[关键词] 碱性磷酸酶；大肠杆菌DH10B；表达纯化；活性分析 　　[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（a）-028-03 　　 　　Study on cloning, expression and activity of alkaline phosphatase from Escherichia coli DH10B 　　LI Jun1,2, HUANG Xia2, YAO Xuemei2, CHEN Xuefen2, QI Xingzhu2 　　1.Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan Province, Haikou 570228, China; 2.Ocean College of Hainan University, Hainan Province, Haikou 570228, China 　　[Abstract] Objective: To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP. Methods: phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR; phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21(DE3); rAKP was detected by immuno-gold chromatography and SDS; the activity of rAKP was determined by pNPP method. Results: Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K, and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control. Conclusion: AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired. 　　[Key words] Alkaline phosphatase; E.coli DH10B; Express and purify; Activity analysis 　　 　　碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AKP广泛存在于多种细菌、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和编码序列差异很大，且各种AKP的性质、结构、功能和催化机制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，相对分子质量为47 K，活性中心包括3个金属原子，即2个锌原子和1个镁原子[2]。 　　E.coli AKP催化机制明确，底物范围广泛，作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。E.coli DH10B无致病性和耐药基因，是基因克隆的常用受体菌。本研究首次从E.coli DH10B基因组中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并进行了表达研究，从而为此种酶的结构、功能和应用研究打下了坚实的基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株、载体 大肠杆菌菌株E.coli DH10B、E.coli BL21（DE3）、E.coli DH5α及原核表达载体pET28a（+）由热带生物资源教育部重点实验室保存。 　　1.1.2