08聚合酶链式反应PPT.ppt

二、实时定量PCR 实时定量PCR（Q-PCR）是一种实时检测PCR 进程的方法，即在PCR 体系中加入一种荧光探针，随着PCR 的进行产生荧光信号，信号强度与PCR 产物水平成正比，所以可以利用对荧光信号的实时检测来跟踪PCR 进程，最后通过标准曲线定量分析起始模板水平。 1、实时定量PCR 探针 时定量PCR 的关键是在PCR 反应体系中加入了一种特异性荧光探针，该探针的5端标记了一个荧光报告基团（fluorophore，R，例如6-FAM，λex＝490nm，λem＝530nm），3端标记了一个荧光淬灭基团（quencher，Q，例如TAMRA）。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR 扩增时，DNA 聚合酶的5‘→3’外切酶活性将探针降解，报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射荧光，每扩增一条DNA 链，就释放一个发射荧光的报告基团，实现了荧光信号累积与PCR 产物合成的完全同步。 荧光报告基团 荧光淬灭基团 实时定量PCR 原理示意图 2．实时定量PCR 应用 与逆转录联合可以定量分析mRNA 以研究基因表达，从而应用于基础研究（等位基因、细胞分化、药物作用、环境影响）与临床诊断（肿瘤、遗传病、病原体）。 3．实时定量PCR 特点 充分利用的了PCR 的高效性、核酸杂交的特异性、荧光技术的高灵敏性和可计量性