DNA提取制备PPT.pptVIP

DNA的制备和分析 为什么需要制备DNA?解决了什么问题？ 20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出双螺旋结构以后，人们才真正认识了基因的本质，即基因是具有遗传效应的DNA片断。 随着“人类基因组计划”测序的完成，人们不再满足于对基因结构的认知，逐渐转向对功能基因组学、蛋白质组学的研究上。DNA作为遗传的基本单位，发挥着重要作用。 基于不同的研究目的，大部分的分子实验都需要制备高质量的DNA，用于各种各样的后续实验。例如：通过引物PCR获得目的基因、酶切、克隆、连接转化和转染和研究DNA-蛋白质的相互作用等。因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 在应用上，制备DNA可用于基因组作图、进化分析、模式生物体进行基因的剔除或转基因的研究。在分子医学领域，制备DNA的基因检测可以用于法医鉴定﹑亲子鉴定﹑遗传病早期检测﹑感染疾病检测﹑肿瘤的诊断和预测 ﹑产前诊断和新生儿筛查 等。 用分子生物学技术研究复杂的基因组，首先必须制备纯净的高分子质量DNA。按制备对象的不同，一般分为3种：动物组织基因组DNA提取、植物组织基因组DNA提取、细菌基因组DNA提取。 但是不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。从某种程度上讲，分子生物学的所有方法都需要分离核酸。色谱技术常用于质粒与基因组的分离，以及从细胞裂解液分离基因组DNA。凝胶电泳技术因其更高的分离度，成为一般情况下首选的分离方法。凝胶电泳技术既可以用于分析，又可用于制备，其分离的核酸片段的分子质量范围从小于103Da到大于108Da。另外还有脉冲电场凝胶电泳、DNA毛细管电泳、Southern杂交技术等。 DNA提取的常见方法： SDS裂解法——动物组织和酵母染色体DNA; CTAB法——植物组织和真菌组织，对产生大量多糖的生物体的核酸提纯非常有效的； 其他 　基因组DNA的提取 　非基因组DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 蔗糖梯度差速离心结合SDS裂解法 高盐一低pH法 DNase Ⅰ法 一.破碎和裂解细胞： ①物理方法：研磨法、匀浆法、超声波处理法； ②化学法：SDS处理细胞法、CTAB裂解细胞法； ③生物法： 蛋白酶K法 、溶菌酶处理法。 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 二.核酸分离纯化： 由于DNA抽提物中往往含有大量的RNA、蛋白质、多糖、酚类物质、盐离子、裂解化合物等杂质，因此需要进一步的分离。 一般采取方法： 有机相抽提法（加等量酚／氯仿／异戊醇）——去除蛋白质。其原理：加入苯酚，可使细胞裂解后的上清液中蛋白质变性，但酚作，为一种弱酸，是微溶于水的有机物，所以为除去酚，需加氯仿作为萃取剂，使酚进入氯仿有机相，从而与DNA水溶液分离成互不相容的两相。异戊醇可以降低表面张力，减少抽提产生的泡沫，并能使离心后水相、变性蛋白质和有机相维持分层稳定。 DNA提取试剂盒 两种方法比较： 传统酚氯仿抽提法 试剂盒提取法 一次提取的DNA量可较大，可供研究员多次使用； 步骤相对繁杂，需要配制较多的溶剂，且酚氯仿为有毒挥发物质，对人体有害。 提取时间较长，至少4h. 提取的模板质量较好，保存时间也长，DNA纯度有保证，技术比较成熟可靠 一次提取的量相对较少，为几十到几百微升； 步骤简单，方便，纯度高； 提取时间较短，大约1h; 试剂盒是有针对性的，通常只对某些规定实验材料有效。并且通常大部分厂家的试剂盒成分组成不公布，导致无法从具体原理和过程引起结果的分析； 试剂盒相对昂贵，对于需制备大量DNA的实验不合算。 三.核酸沉淀、溶解 转移上清至new EP中，用预冷的无水乙醇或异丙醇沉淀。沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀。 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。（重复洗涤3次） 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解，如果溶解困难，可以37℃温育30min。 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制Dnase； pH值为8.0，可防止DNA发生酸解； 为了除去RNA，DNA溶解后可加入RNase A 处理。 e) 置-20 ℃保存备用。 具体实验步骤：（以CTAB法提取植物组织为例） 应提前将研钵及研杵清洗干净，锡纸包裹，烘箱内200℃，2h后待冷却；提前检查试剂是否有效充分；提前将组织在塑料袋内用液氮完全冷冻，放置于- 80℃冷冻保存； (