MAEBT细胞培养技术PPT.ppt

归纳 过程 取 的组织、器官 细胞悬浮液 酶 贴满瓶壁的细胞 单个细胞 加入 液 动物胚胎或幼龄动物 胰蛋白 培养 接触抑制 原代 培养 1-10代细胞 遗传物质 改变 原代细胞 培养 加 液 10—50代细胞 未 遗传物质 改变 无限传代 已 传代培养 胰蛋白 酶 （五）细胞系及其鉴定 1、细胞系：原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂，因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是培养物逐步演进为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的细胞，即细胞系(Cell line)。 当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括: 1)细胞系的细胞来源： 2)鉴定细胞系的纯度：即除了主类细胞外,还杂有哪类细胞。 3)细胞系的稳定性：即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化。 4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等。 2、鉴定内容 3、鉴定指标 1. 形态学 2. 染色体:包括染色体数目和核型分析以及染色体分带技术。 3. 同工酶谱：通常以G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，可根据条件选择。 4.细胞DNA遗传特征: 限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP)，是指在生物进化过程中,DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点,因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短，用同源的克隆DNA为探针就可以探测出。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变,影响内切酶切点，使内切酶酶切片断呈多态性。一般采用Southern印迹杂交法检测。 （六）细胞克隆技术 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为克隆化(cloning)。 细胞克隆技术的方法 1.稀释铺板法(见图) 2.饲养层克隆法(见图) 3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法 4.琼脂克隆法(见图) 5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法.(见图) （七）培养细胞的染色体 1、各种生物体细胞染色体各有其一定的数目、形态和结构，其可作为特化细胞的基本标志。 染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标，是区别正常细胞与恶性细胞的指标。 2、染色体测定项目 1）染色体数目 2）核型分析 3）分带技术： G-,C-带分析 3、具体操作步骤 1）培养细胞：取处于对数生长期，用较大瓶皿培养的80-90%汇合单层培养细胞。 2）加秋水仙素：使用最终浓度为0.02-0.8mg/ml营养液，温箱继续培养6-10小时。 3）采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢固的特点，手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲涮，这样约可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落；注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。 4）离心：收集培养液，1000转/分离心5-10分钟。 5）低渗处理：吸取上清液，加入预温至37oC的0.075MKCL溶液，在温箱中静置20-30分钟。 6）预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸甲醇固定液1ml，用吸管吹打均匀；此操作起到使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。 7）固定：离心，同4），吸除上清液，加新鲜固定液5-10ml，要用一手微斜持离心管，另一手用吸管吸取固定剂，将固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之缓慢流入离心管中，轻轻吹打均匀，放置15-20分钟。 8）重复7），末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5-1ml。 9）制作：用滴片法制片，按如下步骤：将洁净的载玻片放4°C冰箱预冷，滴片前从冰箱取出冷载物片一张，在载玻片表面出现微细水气时，立即向片心一侧滴2-3滴细胞悬液（如固定液不散开，可能因载玻片未洗净或不冷所致）。滴片时的距离保持半米高度较好。滴片在室温中自然干燥，然后镜下观察并记数染色体数。 10）染色和封片：一般常用Giemsa染色，取Giemsa1份+9份PH6.8磷酸缓冲液混均匀，染色10分钟后，水洗，晾干，直接观察（适用油镜），如标本需要保存或做长期观察，可过二次二甲苯，用中性树胶封片。 该过程难在