分子生物学7PPT.ppt

分子生物学常用技术;核酸的分子杂交 Nucleic acid hybridization;;单链DNA被同位素标记后制成探针;;分子杂交的形式： 液相杂交 固相杂交 它们之间的区别和优劣;固相杂交的一般过程 1. 首先设计、合成探针。 2. 收集标本，并提取核酸。 3. 将提好的核酸样本点到固相支持物上。 4. 封闭。 5. 通过变性和复性完成杂交。 6. 漂洗 7. 放射自显影;核酸分子杂交技术的演变 斑点杂交 southern blot northern blot 原位杂交 芯片技术;斑点杂交;;southern blot;southern blot;原位杂交;组织切片上的原位杂交;芯片技术;;GeneChip? Array Construction; ;Dec 2002 Golden Path ;Median intermarker distance: 8.5 kb Mean intermarker distance: 23.6 kb Average Heterozygosity 0 .30 Average minor allele frequency 0.22 ;聚合酶链式反应;PCR技术的形成及发展;PCR示意图;PCR的改进与完善; 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了基础。;PCR 技术的实验原理;;;;;;;;;;;;;;PCR反应的基本条件;引物的设计： 引物的设计首先要依据你已知的序列来设计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料可以从文献上查找或从互联网上来检索。 实际做的过程中，引物也可借助于别人已经发表的引物来。但从经验上说，别人公开发表的引物常常含有一定的错误。所以要进行核查。 ;设计引物应遵循以下原则：??? ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。??? ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。??? ③引物碱基：G+C含量以40-60%???宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 　核苷酸的成串排列。??? ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ; ⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。? ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。??? ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物　量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。;PCR所用试剂： DNA聚合酶 buffer:包括两种，一种是含Mg++，一种是不含Mg++ 。 dNTPs 纯净水 自己要准备的模板DNA的制备和引物的设计与合成。;PCR的操作过程;加样： 单样本加样 多样本加样 加样的顺序 PCR反应条件的设定： 预就性温度： 94℃，5分 变性温度： 94℃，30秒 退火温度： 需要摸条件 延伸温度： 72℃，30秒 总延伸温度： 72℃，15分;;PCR结果的鉴定;RT-PCR(reverse transcription-PCR)