动物细胞培 养课件PPT.ppt

动物细胞培养;前 言 ;组织培养中热门的研究领域 ;组织培养的分类及基本概念 ;组织培养的细胞生物学特点: ;不适应（Deadaption） 细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。 脱分化（去分化）（Dedifferentiation） 由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。;不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。;培养细胞的形态 ;培养细胞的生长和增殖 ;3.衰退阶段： 自发性转化（Spontaneous Transformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）: 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。 如：BHK（仓鼠肾成纤维细胞），F9（小鼠胚胎癌细胞），M2R（黑色素瘤细胞）等。;培养细胞的传代培养 ;细胞传代的三个阶段 ;2) 指数生长期（Logarthmic growth phase）： 细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。;;3)停滞期（Stagnate phase）： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。;细胞培养的基本条件 ;细胞培养的基本条件;细胞培养的基本条件;6)其它添加成分： 缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。 有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。 促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。 贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 可根据培养细胞的特殊要求进行添加。;培养液的物理性质 ;渗透压：培养液渗透压一般介于260~320 mosm/kg之间。 人类血浆渗透压290mosm /kg，小鼠类为310mosm /kg。 粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。 表面张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。;细胞培养的基本方法 ;解离细胞;解离细胞的方法;原代细胞培养 ;3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。 由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞； 通过机械搅动使细胞保持悬浮状态； 通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。;细胞培养中应注意的几个问题 ;4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2~0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。 5）去除死细胞 6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。;细胞系及其鉴定 ;细胞克隆技术 ;细胞克隆技术的方法;细胞系鉴定;细胞系鉴定指标;3.同工酶谱： 通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。;4.细胞DNA遗传特征: 限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。 一般采用Southern印迹杂交法检测。;培养细胞的污染问题及检测 ;细胞污染的种类和判定 ;污染物的检测 ;;支原体检测方法和处理 ;5）污染支原体后的处理： 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。