高效液相色谱法应用基础研究生预习 2.doc

高效液相色谱法应用基础教案 （本科生用） 赵文惠 新疆医科大学中心实验室 第一章 高效液相色谱法应用基础 一 色谱法的历史与发展 100多年前，俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法。一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用是石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样。Tswett把这些色带称为“色谱图”(Chromatogram)，相应的方法叫做“色谱法”(Chromatographic method)。这就是最初的液相色谱，这就是经典的柱色谱。至今为止，这种方法仍然几乎在每一个植物化学试验室均可见到，它被用于从植物提取物中大量制备各种单体，以供药理筛选或结构鉴定或作为制药原料（如雷公藤抗生育有效成分的筛选及雷公藤多甙片的生产）。 图1-4 以CaCO3为固定相、石油醚为流动相的玻璃柱分离系统分离色素的示意图 30年代 茨维特分离绿叶色素，产生固液吸附色谱 40年代 液—液分配色谱法 、TLC、纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代 推出了色谱－质谱联用技术（GC-MS） 70年代 HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大 80年代 出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法 90年代 崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微 微填充柱色谱法的优点 21世纪 色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代的重要作用 二 高效液相色谱原理 色谱分析法（chromatography）简称色谱法或层析法，该法是一种物理或物理化学的分离分析方法，主要用于分析多组分样品。该法利用某一特定的色谱系统（如TLC，HPLC或GC系统等），该系统一般包含二相（一为固定相，一为流动相）。利用多组分样品中各组分在不同的两相之间具有不同的分配系数，当两相相对运动时，这些组分在两相的分配反复多次进行，使分配系数有微小差别 图 1-2 色谱系统示意图 的组分得到分离。分配系数大的组分保留时间长，较慢地被从色谱柱中被洗脱出来。分配系数小的组分保留时间短，较快地被从色谱柱中被洗脱出来。 图 1-2 色谱分离示意图 色谱分析法与光谱法、化学分析法的主要不同在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法及化学分析法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此它是分析混合物最有效的方法。 色谱分析法是利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法。实质：分离方法。目的：定性分析或定量分析 三 色谱法分类 1、按流动相的物态分: –气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(载气) –液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) 2、按固定相的形态分: –平面色谱 纸色谱 薄层色谱 –柱色谱 3、按流动相和固定相的相对极性分: –正相色谱(Normal Phase Chromatography)固定相的极性大于流动相 –反相色谱(Reversed Phase Chromatography)固定相的极性小于流动相 有机化合物的极性–分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力…)综合表现的一种描述 注意:此分类法仅适用于液相色谱 4、按分离过程的机理分: –吸附色谱(Absorption Chromatography) 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 –分配色谱(Partition Chromatography) 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 –离子交换色谱(Ion ExchangeChromatography) 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) –体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel PermeationChromatography) –固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 iltration CGFC(Gel Fhromatography) –固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液 四 高效液相色谱法应用领域 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…。 第二章 色谱法的基本参数及理论 一、保留值(定性参数) 保留时间与保留体积 保留时间（tR）：从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。 保留体积（VR）：从进样到柱后出现浓度最大值所需消耗流动相的