生化实验技术专题PPT.ppt

生化实验技术专题 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。 目录 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测 第一节 生物大分子物质的制备 一．一般过程 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 材料的选择和处理 确立测定方法 细胞的破碎 有效成分的抽提 有效成分的浓缩 生物大分子分离纯化的一般步骤 层析法 电泳法 超离心法 超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 透析 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ 材料选择与处理 细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理） 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶 几种主要沉淀方法比较 注意事项 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基 宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3 第二节 几种重要的生物化学实验技术 一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术 一．层析技术（chromatography） 1．层析技术一般原理 2．层析技术分类及应用 层析技术原理 层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示： ? 样品原点到斑点中心的距离 Rf= —————————————— 样品原点到溶剂前沿的距离 层析法分类（按装置分类 ） 纸层析 薄膜层析 柱层析 洗脱液 样品 填充物 分部收集 玻璃柱 氨基酸分析仪图解 缓冲液泵 显色反应管 茚三酮泵 已分开的氨基酸 离子交换柱 样品注入口 记录仪 光电倍增管 光源 层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 吸附层析 分配层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析 各类层析的原理和载体 类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基