电泳八年制(法)PPT.ppt

生物化学实验(八年制）;课程安排;课程要求;实验操作 标记 用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线 ，在右上角做好标记。 浸泡 将醋酸纤维素薄膜无光泽面向下，在缓冲溶液中浸泡，使其充分浸透。 点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体(不要太干），利用载玻片 一侧蘸取样品，于细线处点样。  电泳 将薄膜无光泽面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负 极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。  染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂，染色5min。 漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次。;电泳技术;发展;电泳的基本概念;电泳用于分离物质的原理（1）;电泳用于分离物质的原理（2）;电泳用于分离物质的原理（3）;设：混合物中有A、B两物质：;影响电泳速度的因素：内因 ;影响电泳速度的因素：外因（1）;影响电泳速度的因素：外因（2）;影响电泳速度的因素：外因（3）;影响电泳速度的因素：外因（4）;电渗：;种类：;电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。;电泳技术的应用;醋酸纤维薄膜：是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中。（醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白） 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。（等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C） 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质;;表-1 血清中各蛋白质的相关特性;蛋白质染料氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已??少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。 ;优缺点;临床意义：;聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分离Hb和细胞色素C;聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：;;原理：; 等点聚焦特点;pH梯度的形成;pH梯度的形成;;理想的两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 两性电解质载体的pI愈连续，形成的pH梯度愈平滑。 ;Ampholine(瑞典LKB);抗对流支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）;反应方程式：;聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式;AP-TMTED催化体系：;影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素;聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的优点：;;样品的预处理;操作方法：;;;（5）上样，电泳 小心地拔出玻管，把管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升到200 V，电泳至电流降为0，关闭电源。 ;（6）割胶，测PH 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。 用蒸馏水冲洗，将pH试纸插入所需测定的蛋 白区带，测pI。;注意事项：;思考题：