芽孢杆菌腺苷磷酸的化酶在大肠杆菌中的表达及酶学特性.doc

芽孢杆菌腺苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及酶学特性 中国医药工业杂志ChineseJournalofPharmaceuticals2007,38(9) 芽孢杆菌腺苷磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及酶学特性 高淑红,全敏,胡慧莉,陈长华,张嗣良 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,国家生化工程技术研究中心,上海200237) ?629? 摘要:对芽孢杆菌的腺苷磷酸化酶基因deoD在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行优化.确定在菌体培养的对数生长 中期进行诱导,异丙基.13-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为0.05rnmol/L,诱导温度为37~C.腺苷磷酸化酶的最适pH为 7.0,反应温度为50~C,其底物范围广,对腺苷,肌苷均有催化活性. 关键词:腺苷磷酸化酶;deoD:蛋白表达;底物特异性 中图分类号:Q75文献标识码:A文章编号:1001-8255(2007)09-0629-04 ExpressionofdeoDGeneCodingforAdenosinePhosphorylasefromBacillussp. inE.coliandEnzymaticProperties GAOShu—hong,QUANMin,HUHui—li,CHENChang—hua,ZHANGSi—liang (StateKeyLab.ofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceamp;Technology, NationalEngineeringResearchCenterforBiotechnology,Shanghai200237) ABSTRACT:TheexpressionofdeoDgenefromBacillussp.inE.coliBL21(DE3)wasstudied.Toachievethe highlevelofexpression.IPTGwasaddedinthemiddleexponentialgrowthperiodupto0.05mmol/Lat37~C.The propertiesofadenosinephosphorylasewereinvestigated.TheoptimumpHvalueandtemperatureforthisenzymewere 7.0and50.C.Itwasshowedthatthisenzymepossessedabroadspecificitytothesubstratesincludingbothadenosineand inosine. KeyWords:adenosinephosphorylase;deoD;proteinexpression;substratespecificity 嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleosidephoS. phorylase,E.C2.4.2.1)可在嘌呤核苷酸的补救途径 中催化嘌呤碱基和嘌呤核苷的相互转化,在产气肠 杆菌,枯草杆菌,短杆菌等很多微生物中都存在. 许多抗病毒,抗肿瘤的核苷类药物是由化学法合成 的,但往往涉及多步反应,且收率低,还有立体构 型等问题.由于嘌呤核苷磷酸化酶能够催化糖苷键 的形成,有望降低合成此类药物的生产成本,缩短 反应路线,经济价值较大[.许多核苷类药物如病 毒痤(virazole),阿糖腺苷,5’一脱氧一6一硫代鸟嘌呤 核苷(5’-deoxy一6一thioguanosine)等都能用核苷磷酸 化酶来催化制得E24]. 收稿日期:2006—12.01 作者简介:高淑红(1975),女,讲师,从事发酵和基因工程研究. Tl;021E-mail:gshongsh@ecustedu.cn 本研究从芽孢杆菌ATCC21616中扩增出腺苷磷 酸化酶的编码基因deoD,与表达载体pET28a(+)连 接,转化大肠杆菌BL21(DE3),在大肠杆菌中实现了 表达[.许多研究表明细胞生长速率显着影响外源蛋 白的表达,因此必须对细菌接种量,诱导前细胞生长 时间和诱导后细胞的密度进行控制,生长过度或过速 都会加重细菌合成系统的负担.为了提高目的蛋白的 表达水平,本研究对诱导剂异丙基一D—D.硫代半乳糖苷 (IPTG)的浓度,诱导时机和诱导温度进行优化,并研 究了腺苷磷酸化酶的酶学特性. 1仪器与材料 1.1仪器和试药 高效液相色谱系统(1525型二元泵,2487型紫外可见光 检测器)(Waters公司);5804R型高速低温离心机(F34.6.38 型转子,Eppendorf~司);JY92.II型超声波破碎仪(宁波新 芝生物科技股份有限公司). 蛋白胨,酵母粉(Oxoid);咪唑,腺嘌呤,腺苷,肌苷, 次黄嘌呤,尿苷,尿嘧啶(上