第11章 基因表达和功能的PPT.ppt

第十一章 基因表达和功能的研究;主要内容;11.1. 克隆基因转录的研究;11.1.2 通过核酸酶处理来研究DNA-RNA杂交物;消化单链部分;11.1.3 通过引物延伸来研究转录物 确定转录起始点的研究;11.1.4 其他研究RNA转录的技术;11.1.4 其他研究RNA转录的技术;11.1.4 其他研究RNA转录的技术;SMARTTM 3‘-RACE的原理是: 1、利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核核酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。 2、然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer,GSP)作为上游引物。 ;; 2、利用逆转录酶具有末端转移酶的活性，使末端加上寡聚C。;;11.2 基因表达调控的研究;11.2 基因表达调控的研究;Electrophoretic mobility shift assay, EMAS;原理: 蛋白与DNA结合 后,保护这段被结合的DNA不被内切核酸酶降解,电泳检测不到这段被覆盖的蛋白,形成类似脚印的区域. 具体实验过程描述:P197;修饰干扰实验;11.2.2 通过缺失分析来识别调控序列;缺失分析 将具有不同程度缺失的调控序列与报告基因融合的载体,转化给宿主,检测宿主中报告基因的表达模式以及强度的方法;;11.3 鉴定和研究基因的翻译产物;11.3 鉴定和研究基因的翻译产物;11.3.2 通过体外突变研究蛋白质;11.3.2 通过体外突变研究蛋白质;盒式突变举例1;AGCT;B、人工基因合成方法 1、原理 利用一段人工合成的150甚至更长的碱基（内含需要突变的位点）,通过部分重叠和DNA聚合酶的延伸完成整合基因的多个位点的突变。;C、定点诱变的PCR方法 根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物A和A’(引物A和A’互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变； 分别以左侧引物A和右侧引物A’进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的及外侧引物B和C的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA序列中但远离两端的突变体。 ;5’;11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的研究 ;11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的研究;11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的研究;B、酵母双杂系统的组成部分 （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵???白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 C、酵母双杂系统的工作原理 ;Gal4结合域;BD;用途： 快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新基因 验证 已知蛋白间的相互作用及作用强度;优点： 根据兴趣蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白 蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来 可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。;局限性： 表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确 本身就具有转录激活活性 的兴趣蛋白不适合于该系统 不能定位于核内 的兴趣蛋白不适合于该系统 需要翻译后修饰的蛋白 不适合该系统;