第1次：从体内到体外060209PPT.ppt

2) EDTA溶液： EDTA是一种化学螯合剂，其溶液又称Versene液，对细胞有一定的解离作用，且毒性少、价格便宜，使用方便。 常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，这主要根据培养细胞的种类进行选择。 3）胶原酶溶液（collagenase solution）： 有胶原酶I、II、III、IV型以及肝细胞专用胶原酶五种。 （四）培养用液 ３、其它常用液 （1）消化液 （2）消化酶抑制剂（enzyme inhibitor） ３、其它常用液 贴壁生长的细胞传代时须使用消化酶使细胞脱离生长表面。 在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用。 在无血清培养时，则必须使用消化酶抑制剂，以保护细胞免受残留的消化酶的损害。 目前常用的酶抑制剂是大豆胰酶抑制剂。 （四）培养用液 ３、其它常用液 （3） pH调整液 1) NaHCO3溶液： 为了使培养液营养成分稳定和延长贮存时间，一般不预先在培养液中或平衡盐溶液中直接加入NaHCO3，而是单独配制，消毒除菌后，在使用前加入。 2) HEPES溶液： HEPES的化学名全称为：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。 它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，尤其是在开瓶通气培养或观察时能维持正常pH。 （四）培养用液 ３、其它常用液 （4）抗生素液 为了预防因无菌操作不严而发生污染，培养液内一般需加入适量的抗生素。 用于体外培养的抗生素以青霉素应用最普遍。通常在培养液中的终浓度为20～100ＩU/ml。 青霉素可以和链霉素（使用浓度为50 μg/ml)联合应用抑制耐青霉素的菌株。 （5）谷氨酰胺溶液 （略） （四）培养用液 实验课地点：104馆三楼东边 １、无污染的 气、液相环境 ２、温度 ３、生长基质 O2 CO2 液相环境 多聚赖氨酸 纤维连接蛋白 胶原 层粘连蛋白 亲玻粘连蛋白 韧粘素 （五）细胞在体外生长的其它条件 １、无污染的气、液相环境 体外培养技术特别强调无菌操作。 组织取材、细胞分离、种植、传代、孵育以及利用培养的细胞进行各种实验时，都必须在无污染环境下进行；培养所用的各种器具、液体以及其它用品都需严格消毒灭菌，以保证培养物不被污染。 在无污染的前提下，必须为培养物提供适宜其生存和生长的气、液相环境。 （五）细胞在体外生长的其它条件 （１）大型设备和仪器 （２）培养器具 过滤除菌(filtration sterilization)装置 手术器械(surgical instruments) 培养器皿(ware for culture) 移液器(transferpettor) 特殊用具 杂用品 ２、体外培养实验室的设备和器具 真空式过滤器 正压式不锈钢滤器 抽滤式玻璃简易型滤器 针头式滤器 （１）大型设备和仪器 （２）培养器具 过滤除菌装置 手术器械 培养器皿 移液器 特殊用具 杂用品 ２、体外培养实验室的设备和器具 细胞过滤器 细胞冻存管 微量移液枪吸头 １、水与平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS) ２、培养液(culture solution) ３、其它常用液 进行体外培养离不开适应细胞在体外生存和生长的各种溶液，此即培养用液。 培养用液主要包括培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等其它常用液。 （四）培养用液 １、水与平衡盐溶液 水与缓冲液 生理盐水与 平衡盐溶液 培养用水 缓冲溶液 生理盐水 平衡盐溶液 ２、培养液 ３、其它常用液 （四）培养用液 １、水与平衡盐溶液 水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其它成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。 用金属蒸馏器制备的蒸馏水（distilled water，DW），可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。 配制培养用液应用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。 二次蒸馏水或外购的纯水只能用于清洗。 （１）水与缓冲液（buffer solution） 培养用水： （四）培养用液 蒸馏水的贮存也很重要，蒸馏水应贮存于密封的清洗干净的玻璃瓶内，最好用龙头瓶贮存，用时由瓶下端的玻璃龙头放水。 尽量少开启瓶口或从瓶口倒水，以防周围不洁的环境和空气污染水。 制备的水存放时间不宜太长，一般不超过2周，最好现制现用。若将所制备的蒸馏水经高压蒸汽消毒，可密封存放较长时间。 （四）培养用液 １、水与平衡盐溶液 （１）水与缓冲液（buffer solution） 培养用水： 由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲（溶）液(buffer solution)。 缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。如碳酸氢钠／碳酸（NaHCO3／H2CO