第八章 基因文库与克隆分析应用PPT.ppt

第八章 基因文库与克隆分析应用 一、复习 二、目的基因的获得 三、外源基因的表达系统 四、PCR技术及其应用 复习 DNA重组技术基本步骤 ?目的基因的提取:供体生物基因或称外源基因的 提取 ?限制性酶切：目的基因切成不同大小的片段 ?酶接（连接）：连接到另一DNA分子上（克隆载体） ?转化:将这个重组DNA分子转入受体细胞 ?筛选和鉴定:对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定 ?基因表达：进行培养，检测外援基因是否表达。 1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid） 理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： ①能在宿主细胞中自主复制。 ②容易进入宿主细胞。 ③容易插入外来核酸片段。 ④容易从宿主细胞中分离纯化， 便于重组操作。 ⑤容易被识别筛选。 复习 质粒的生物学基本特性： 自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中。 稳定性：质粒在宿主细胞中保持着一定的考贝数 寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制 表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等。 复习 ? 复制类型 质粒在细胞内的复制是受到一定控制的，按其所受控制的程度可分为两类：严紧型和松弛型。 严紧型质粒的复制受到严格的控制，每个细胞中的数量只有1～2个，它们似乎与染色体的复制受相同因素的控制，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，质粒也不复制。 松弛型质粒的复制不受严格的控制，在整个细胞生长周期中可以随时复制。当用药物抑制了染色体的复制后，它们可以照样复制，显示出与染色体复制受不同因素的控制，因此它们在细胞中可以有较多的数量，一般可达10余个甚至更多，如ColE1质粒。 质粒复制控制的类型，有时是和它存在的细胞有关，如某些R质粒在大肠杆菌中复制是严紧型，而在变形杆菌中则是松弛型。 复习 二、目的基因的获得 （一）原核生物基因文库的构建 1、限制性酶切：对提取的总DNA酶解，产生出所有可能大小的片段。 2、载体连接： ? 电泳分离后的DNA片段与载体连接。 3、转化： ? 将带有外源DNA的载体导入宿主细胞。 ? 化学方法 用10 mM CaCl2 在0 ℃条件下低渗处理，使细胞肿胀，加入的 DNA可以吸附在细胞的表面，加热42 ℃ ，DNA便被吸入细胞。 感受态细胞的制备  ?1、取保存的菌接种于LB固体培养基， 37 ℃培养过夜(不超过16h) 2、挑取单菌落至5ml LB液体培养基，37 ℃ ，200rpm培养过夜 3、按1：100（可以1：200或更多）取1ml培养菌液转入100ml LB液体培养基中，37 ℃ ，250rpm培养至OD600=0.3至0.4，立刻置于冰上，10 分钟(严格冰上操作，轻柔，避免较大的振荡)。 4、4000 rpm离心5 min（JA-20，beckman），去上清，加入12 ml 0.1 mol/L CaCl2溶液，悬浮沉淀，冰浴20 min 5、4000 rpm离心5 min，去上清，加入8 ml 0.1 mol/L CaCl2及15%甘油（建议细菌浓度更高），悬浮沉淀。 6、以每管200ul分装，-70 ℃保存备用（可以液氮速冻） 7、以标准质粒确定感受态细胞的转化率 二、目的基因的获得 二、目的基因的获得 二、目的基因的获得 ? 电穿孔法 利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA便可进入。 4、重组子的筛选与鉴定 常用于筛选鉴定的方法有以下几种： a、抗生素抗性筛选 b、抗性的插入失活 c、蓝-白斑筛选 ? 如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。 二、目的基因的获得 二、目的基因的获得 二、目的基因的获得 d、PCR筛选 ? 利用能与插入片段两端互补的特异性引物,以小量抽提的DNA进行PCR分析,能扩增出特异片段的为转化目的重组子。 PCR的反应体系要具有以下条件： ? 被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物（约20个碱基左右）。 ? 具有热稳定性的酶如：Taq DNA聚合酶及其缓冲液。 ? dNTP ? 作为模板的目的DNA序列 e、DNA杂交筛选 1、所谓DNA探针，实质上是以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的一段已知的基因片段。应用这一基因片段即可与待测样品