第八章 分子克隆技术PPT.ppt

琼脂糖凝胶电泳: 不同构型的DNA，其迁移率不同，最前面的是SC DNA，依此为L DNA 和OC DNA。 质粒在寄主细胞中的作用: “友好”地“借居”在宿主细胞中，既不杀死细胞，对宿主的代谢活动也无影响； 借助本身带进去的基因在细胞中表达其遗传信息，编码一些重要的非染色体控制的遗传性状，为宿主执行一些适当的遗传功能。如对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。 质粒的类型: 松弛型质粒（relaxed plasmid ）：分子量较小，不具传递能力。其复制在松弛控制下进行。每个细胞拷贝数约10－200个。 根据质粒在细胞中拷贝数目的多少，分为： 严谨型质粒（stringent plasmid ）：分子量较大，多是具传递能力的大质粒；DNA复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制；每个细胞仅1－2个拷贝。 改造载体: 1.1 pBR322（万能质粒） 大小：4.3kb 复制子：松弛型 筛选标记：ampr, tetr 单一切点：EcoRⅠ , Hind Ⅲ, BamHⅠ 等. 插入失活：PstⅠ, PvuⅠ 等; SalⅠ, SphⅠ 等. pBR322的优点： 具有较小的相对分子质量(4361bp); 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr); MCS具有多个单酶切位点，可供外源基因的插入； 具有较高的拷贝数（25个, 松弛型）。 含四个部分： （1）来自pBR322的质粒复制起点（ori）； （2）ampr抗性 ; （3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列； （4）多克隆位点（MCS） 1.2 PUC质粒 PUC的优点： 基因组小，拷贝数高，克隆DNA产量高； 有LacZ’筛选标记，LacZ’基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳性克隆； 有MCS，其中有13个以上的单一限制位点，可用于外源基因克隆。 噬菌体PGEM质粒经EcoRV酶切产生的末端带T的载体，能直接克隆PCR产物。 在PUC质粒的MCS两侧加入噬菌体T7和SP6的DNA聚合酶启动子，可用于基因的表达。 1.3 PGEM-T ： 1. 重组体DNA分子的构建 主要依赖于核酸内切酶和DNA连接酶作用 （1）外源片段定向插入载体 载体和待克隆的DNA分子用核苷酸内切酶切割后，混合起来，退火形成重组DNA分子。 插入式：用同一种限制性内切酶消化 取代式：用两种限制性内切酶消化 （2）非粘性末端DNA分子间的连接 使用T4 DNA连接酶可将平末端DNA片段连接起来，但效率较低; 使用附加衔接物方法可提高平头末端间连接的效率。 带有外源DNA片段的重组体分子在体外构成之后，需要导入适当的寄主细胞中进行繁殖，才能够获得大量纯一的重组体DNA分子。 受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌等原核生物细胞，既可作基因文库的复制扩增场所，也可作为外源基因的表达系统。 酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核生物细胞，仅作外源基因的表达系统。 2. 重组体进入受体细胞 转化（transformation）：以质粒为载体构建重组DNA导入受体细胞的过程。 转染（transfection）：以噬菌体和真核病毒作载体构建重组体并导入受体细胞的过程。 显微注射（microinjection）、电钻孔：适用于高等动植物的真核细胞。 （1）重组体DNA导入细胞的途径： （2）细胞的转化 取出感受态细胞，加入连接反应混合物，42度热休克90s，立即冰浴，再加LB培养基，使细菌复苏。然后，经适当稀释，涂布在琼脂板上，37度培养12－24h。 感受态细胞（competent cell）: 用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高细胞膜通透性，使外源DNA分子能容易进入细胞内部。 大肠杆菌感受态细胞制备 1. 将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。 2. 取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB试管中，于恒温振荡器上，37℃振荡培养过夜（约16 小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。 3. 用移液管无菌条件下，取过夜培养液1 毫升，接种于新鲜的LB 中（100毫升LB/250毫升三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右），于恒温振荡器上37℃培养2—3 小时。 4. 无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2 支。 5. 带菌液的离心管置于冰上10 分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r/min 离心5 分钟。 6. 无菌条件下，倒去上清LB，倒斜离心管，让LB 流干，留下沉