第六章 细胞培养的基本技术PPT.ppt

第三节传代培养和细胞系的维持 传代培养的原因？ 原代培养后，由于细胞数量增加，整个培养器皿，逐渐被细胞覆盖，如果不进行传代培养细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。 一、原代培养的首次传代 传代：细胞由原代培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代。 二、细胞传代方法 1、贴壁细胞的消化法传代 二、细胞传代方法 1、贴壁细胞的消化法传代 （1）吸出或倒掉瓶内的旧培养液。 （2）加入适量的消化液消化。 （3）镜检，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化 （4）吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液 （5）技术，接种到新的培养瓶。 二、细胞传代方法 1、悬浮细胞的传代 悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心5min,然后取出上清，加入新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。 细胞系的维持是通过换液，传代，再换液、再传代和细胞冻存实现的。 三、培养细胞的维持 细胞系的维持注意的要点： 1、细胞系档案要记录好。 2、细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，要注意保持其稳定的规律性。 3、多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染。 4、每一种细胞都应有充足的冻存储备。 四、细胞培养的常规检查 1、检查营养液的pH值。 新鲜培养液呈橙红色（pH7.2） 细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物质积累增多，营养液酸化变黄，pH下降 四、细胞培养的常规检查 2、细胞污染的检查。 细菌污染检查 真菌污染 支原体污染 细胞交叉污染 化学物质污染 第五章 细胞培养的基本技术 第一节、培养细胞的取材和分离 一、培养室内的无菌操作 （1）培养前的准备 （2）培养室和超净台的消毒 （3）洗手和着装 （4）无菌培养操作 二、培养细胞的取材 （1）取材的基本要求 A、取材的组织最好尽快培养。 B、取材时应严格无菌消毒。 C、取材和原代培养时要用锋利的器械如手术刀片切碎组织，尽量减少对细胞的机械损伤。 二、培养细胞的取材 （2）组织材料的分离 目前常用分散组织的方法有机械法和化学法两种 二、培养细胞的取材 （2）组织材料的分离 A、细胞悬液的分离方法 如材料为血液、羊水等细胞悬液时，一般采用低速离心方法。 （2）组织材料的分离 B、组织块的分离方法 a、机械分散法 （2）组织材料的分离 B、组织块的分离方法 b、剪切分离法 （2）组织材料的分离 B、组织块的分离方法 c、消化分离法 消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。 胰蛋白酶法、胶原酶法、EDTA法 三、细胞的计数 血球计数板 16中格×25小格计算公式：细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数 25中格×16小格计算公式：细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数 在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。 第二节原代培养 原代培养：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。 原代培养分为： 一、组织块培养法 二、消化培养法 三、器官培养法 一、组织块培养法 组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。 一、组织块培养法 步骤： 1、取材修剪冲洗 2、剪成1mm3左右的小块 3、移入培养瓶 4、间距5mm分布组织小块 5、翻转培养瓶37℃静止1-2h 6、翻正培养瓶培养 7、原代细胞培养 一、组织块培养法 二、消化培养法 1、消化分离法消化细胞 2、镜检，发现组织已分散成细胞团或单个细胞，终止消化，筛网过滤，大块继续消化。 3、过滤的消化液，低速离心，加培养液，细胞计数后，接入培养瓶。 * *