仪器分析第三篇 高效液相色谱分析.ppt

第三章高效液相色谱分析 High Performance Liquid Chromatography, HPLC §3-1 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。 1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa 高速： HPLC流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：化学键和固定相, 30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 2、HPLC与GC的区别 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 §3-2 高效液相色谱法理论基础 速率方程： H=A+B/u+Cu （1）液体的扩散系数仅为气体的万分之一，HPLC中速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计， （2）影响柱效的主要因素是传质项。 2、提高柱效的途径： 提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体） 选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度; 减小粒度是最有效的途径. §3-3 高效液相色谱法 主要类型及分离原理 1、液液分配色谱法 2、液固吸附色谱法 3、离子交换色谱法 4、离子对色谱 5、空间排阻色谱法 1、液-液分配色谱 正相色谱与反相色谱比较 正相色谱——固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分 反相色谱：固定相： C-18柱 流动相：甲醇-水或乙腈-水 2、液-固吸附色谱 3、 离子对色谱（分离有机酸、有机碱） 4、 离子交换色谱 5、空间排阻色谱 §3-4 液相色谱固定相 化学键合固定相 化学键合固定相的特点 2.液-固吸附色谱固定相 3.离子交换色谱分离固定相 4. 空间排阻分离固定相 §3-5 液相色谱的流动相 2. 选择流动相时应注意的几个问题 3. 流动相选择 §3-6 高效液相色谱仪器 液相色谱仪（1） 液相色谱仪（2） 流程及主要部件 process and main assembly of HPLC 2.主要部件 梯度洗提装置（P84） (2) 进样系统 (3) 色谱柱 (4) 检测系统 光电二极管阵列检测器（PAD、DAD） b. 荧光检测器（FLD） 特点： 高灵敏度、 高选择性； 对多环芳烃，维生素、氨基酸、蛋白质等有响应； c. 示差折光检测器（通用型检测器） （ differential refractive index detector） §3-7 高效液相色谱分离类型选择 choice of separation types 2、根据溶解度选择 样品溶于水不离解——反相色谱 样品溶于水并能离解——离子交换色谱 样品溶于烃类（苯或异辛烷）——液固吸附色谱 样品溶于甲醇——反相色谱 3、根据分子结构选择 异构体——液固吸附色谱 同系物——正相色谱、反相色谱 §3-8 HPLC的应用 application of HPLC 2. 稠环芳烃的分析 §3-9 液相制备色谱 1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 制备柱允许超载（以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜） 2. 液相制备色谱的方法 3.液相制备色谱仪 注射器、进样阀（六通阀） 通常使用六通阀， 柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为4.6 mm 或 3.9mm，柱长15～30 cm，填料一般5~10?m。发展趋势是减小填料粒度以提高柱效和减小柱径减少