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过敏性紫癜急性期辅助性T细胞亚群变化和血浆转化生长因子-β1水平研究 研究生：董胜英（儿科学） 导 师：张秋业 （副教授） 主要器材 .SW-CJ-1F型净化工作台(苏州净化设备厂) BNP-310型CO2培养箱(日本太阳文昌株式会社) LK5-2A型低速离心机(北京医用离心机厂) GL-16B型高速离心机（北京医用离心机厂） 显微镜 加样器 1575洗板机(BIO-RAD公司) 550型酶标仪(BIO-RAD公司) Forma Scientific 超低温冰箱（最低达-80oc） 主要试剂 .PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate ，Sigma公司) Ca2+导入剂(Ionomycin， Sigma公司) RPMI-1640培养基(Hyclone公司) 精制小牛血清(Hyclone公司) 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) IL-4、IFN-γ、TGF-β1 ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程公司) 研究对象 HSP组：选择2001年10月至2002年12月我院及儿童医院住院HSP急性期患儿38例，男20例，女18例；年龄4-13岁，平均年龄7.12岁。其中进行外周血单个核细胞（PBMC）培养20例，男11例，女9例；年龄5-10岁，平均年龄6.08岁。根据皮疹消退前和消退后两周内有无肾损害的临床依据，将HSP患儿分为无肾损害组与有肾损害组，诊断标准依据中华儿科学会肾脏病学组修订的紫癫性肾炎的诊疗建议方案。38例HSP患儿中28例无肾损害，男13例，女15例；年龄4-10岁，平均年龄6.57岁；10例有肾损害，男7例，女3例；年龄6-13岁，平均年龄8.7岁。其中进行PBMC培养20例患儿中15例无肾损害，男9例，女6例；年龄5-10岁，平均年龄6.8岁；5例有肾损害，男3例，女2例；年龄6-10岁，平均年龄7.8岁。 对照组：16例，男9例，女7例，选自我院门诊体检的健康同龄儿童，年龄4~14岁，平均6.5岁。近期无感染及过敏性疾病等病史，无免疫制剂应用史。其中进行PBMC培养15例，男9例，女6例，年龄4~14岁，平均6.67岁。 研究方法 1.标本采集：入院后次日采血，无菌操作采取急性期HSP患儿和对照组儿童外周静脉血5ml，加入无菌肝素抗凝管。 2.PBMC分离与培养：严格无菌操作，所用器皿、试剂经高压或抽滤灭菌。 ⑴ 将抗凝血于1800rpm离心5分钟， 移取血浆1ml于-80℃保存以备测。移取血浆后的剩余抗凝血中加入等体积含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液稀释。 ⑵ 以2：1比例将稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上，于2000rpm离心20分钟。 ⑶ 吸取淋巴细胞层，移入EP管中，用含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液混匀，于15000rpm离心1.5分钟，弃去上清，重复洗涤2次。 ⑷ 末次离心后，弃去上清，加入含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液0.1ml，混匀，取一滴计数，按所计算细胞的浓度，再加入一定量的含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液配制成1×107/ml的细胞悬液。 ⑸ 用移液器取100μl上述细胞悬液，加入无菌含PMA和Ca2+导入剂的培养瓶中，PMA浓度为15ng/ml，Ca2+导入剂浓度为2ug/ml。培养瓶内含有0.9ml含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液,混匀后配制成1×106/ml的细胞悬液。 ⑹ 将无菌培养瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时。 ⑺ 培养48小时后，15000rpm离心30秒，收集上清液500μl于-80℃保存以备测。 3.培养上清中IL-4、IFN-γ、TGF-β1及血清中TGF-β1的测定 严格按说明书操作 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。结果呈正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，采用组间或自身配对t检验或t′检验，相关分析采用直线相关分析法。P0.05定为差别有显著性意义。 ? 一、HSP患儿急性期PBMC体外诱生IFN-γ、 IL-4和TGF-β1水平 HSP患儿急性期PBMC经PMA+Ca2+导入剂体外诱生INF-γ水平为（28.113±5.522）pg/ml，较对照组儿童{（40.195±6.084） pg/ml}显著低下，差异有极显著性意义(t=6.133, P0.01)； IL-4水平为(39.737±8.966) pg/ml，较对照组儿童{（22.065±6.171）pg/ml}显著升高，差异有极显著性意义(t=6.548, P0.01)； IFN-γ/IL-4比值(0.742±0.222)较对照组儿童(2.003±0.832)明显降低，差异有显著性意义(t′=5.717,