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一、实验原理 银染是一种重要的PAGE染色方法，由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏度高而被广泛应用。银染的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出凝胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测。 二、实验试剂 1. 乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA钠盐、去离子水、甲醛。 三、实验步骤 1. 固定 量取100ml 乙醇，25ml 冰醋酸加去离子水到250ml(视胶板大小情况，适当等比例配制，增加固定液量，以下相同。)，使其终浓度达到 40% 乙醇，10% 冰醋酸。将凝胶板浸入固定液中，固定30min以上。 2. 水洗 去离子水浸泡。3x 10 min。 2. 致敏 生物科研提醒：量取75ml 乙醇，17g 乙酸钠或28.2g三水乙酸钠，0.5g硫代硫酸钠加去离子水到体积250ml。将固定后的凝胶板拿起，浸入致敏液中，浸泡30 min。 4. 水洗 去离子水浸泡。3x 10 min。 5．银染 0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml。将胶板浸入银染液中，浸泡30 min。 6．水洗 去离子水浸泡。3x 20 sec。注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色。水洗不充分，背景较深。 7．显色 6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加去离子水到终体积250ml。2-15min，显色时间视凝胶大小、厚薄情况而定。看到各条带，即可将凝胶捞出。 8．终止 3.65g EDTA钠盐或者1g 甘氨酸加去离子水到终体积250ml。浸泡凝胶10 min。 9．保存 1% 冰醋酸，4 ℃。 四、注意事项 1．银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。 2．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。 3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。 4．对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。 5．银染液和显色液需要预冷。 6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染。 7．SDS凝胶中的巯基乙醇会导致在60 KDa或67 KDa处出现两条水平线。减少巯基乙醇的用量即可避免。。 8．染色、水洗等过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm。没有设备，用手推轻晃亦可。 9．凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 10．凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。丙烯酰胺中的杂质也会导致呈现较深的背景。 11．如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。 12．在最初甲醇洗脱时就应该先除去甘油、尿素、甘氨酸、Triton X-100和两性电解质这些干扰性物质。 13．室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果，恒温水浴可以解决这个问题。 14．当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以改进染色效果。 15．据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色提高40倍。在染色效果不佳的情况下可以考虑。 16．银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带会变浅，而背景会加深。 17．不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此不宜用银染测定不同蛋白的比例。