TGFβ1—Smad3—ILK信号转导通路与大鼠肝纤维化相关性研究.docVIP

TGFβ1—Smad3—ILK信号转导通路与大鼠肝纤维化相关性研究 　　[摘要] 目的 研究TGFβ1-Smad3-ILK信号转导通路与大鼠肝纤维化的关系。 方法 建立40%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型。60只SD大鼠随机分为5组：正常对照组、模型2周组、模型4周组、模型6周组、模型8周组。对模型2、4、6、8周组及对照组大鼠行HE染色、网状纤维染色、免疫组织化学反应，观察肝组织病理变化、纤维增生及ILK和TGFβ1-Smad3的表达情况。 结果 免疫组织化学染色显示，ILK和TGFβ1-Smad3在正常的肝组织中几乎没有表达。在注射CCl4后，大鼠肝脏组织中ILK和TGFβ1-Smad3较正常对照组表达明显增强，模型2、4、6、8周组中ILK和TGFβ1-Smad3的表达程度呈明显递增趋势，表明大鼠肝组织纤维化与ILK和TGFβ1-Smad3的表达有关。 结论 ILK和TGFβ1-Smad3的表达可能与大鼠肝纤维化有联系，如能继续深入研究TGFβ1-Smad3-ILK信号转导通路在肝纤维化中的发生机制，或许可为肝纤维化的防治提供新的理论依据。 　　[关键词] TGFβ1-Smad3；ILK；信号转导通路；肝纤维化 　　[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）12（c）-0014-06 　　肝纤维化指多种慢性肝病共同病理变化的过程，也是肝硬化恶化、发展的重要环节。现阶段，肝纤维化化是可逆的，对于肝纤维化进行早期诊断、早期治疗，能够有效抢救治疗慢性肝病患者，降低社会经济损失。本研究主要探讨转化生长因子β1（TGFβ1）-Smad3-整合素连接激酶（ILK）信号转导通路与大鼠肝纤维化的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物与材料 　　本次研究试验动物选取健康雄性Sprague Dawley（简称SD）大鼠60只，体重200～260 g，由江西中医学院实验动物中心提供。全部SD大鼠根据常规饲养条件将室温调节至（21±3）℃，调节湿度为（54±6）%，每天喂养12 h，均给予普通饲料，并且自由进食、进水。垫料应每周更换2次。大鼠TGFβ1单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.2 实验方法 　　应用40%CCl4制备大鼠肝纤维化模型。将60只大鼠随机分成正常对照组（12只）、模型2周组（12只）、模型4周组（12只）、模型6周组（12只）、模型8周组（12只）。模型组按首次0.5 ml/100 g，以后0.3 ml/100 g给予40%CCl4中性花生油腹腔注射，???周进行2次，共计8周。每周测量一次大鼠体重，并给予合理剂量调整。正常对照组采用等量生理盐水腹腔注射，每周2次。从腹腔注射CCl4诱导液以后1周开始，每隔2周时间处死1组模型组大鼠，直到第8周组，在最后一次注射诱导液后24 h处死大鼠。正常组12只大鼠统一于第8周末处死。将处死的大鼠仔细摘除肝脏，取其肝脏标本待查。取小块肝脏组织固定于预先配置的10%甲醛中，常规制备石蜡切片，比较2、4、6、8周4个组大鼠肝纤维化模型与对照组大鼠之间的免疫组织化学反应、网状纤维染色以及肝苏木素-伊红染色，同时注意肝组织病理改变情况、纤维增生程度及ILK和TGFβ1-Smad3的表达情况。 　　1.3 病理学检查 　　肝组织用10%中性福尔马林液固定，通过常规方法加以免疫组织化学反应、网状纤维染色以及肝苏木素-伊红染色，注意每组大鼠肝组织病理改变、纤维增生程度及ILK和TGFβ1-Smad3的表达情况。 　　1.4 肝纤维化半定量积分 　　通过王泰龄等[1]研究人员改进的Chevallier计分法制订纤维化程度计分标准，具体见表1。 　　表1 纤维化程度计分标准 　　计分表示为L+P+2（N×W）；*标本内仅一细纤维隔，W计分0.5分 　　1.5 ILK和TGFβ1-Smad3免疫组织化学染色结果评定： 　　在高倍镜（×400）观察下，随机性观察5个视野，每个视野中细胞计数应该300个，染色结果需与阳性细胞比例、着色深浅程度相对比予以半定量分析。结果评判标准：将细胞膜、细胞质染色表现黄色-棕褐色作为阳性细胞，没有着色作为阴性细胞。同时按照每张切片显示的阳性细胞比例、着色深浅程度进行积分。具体积分：阳性细胞51%视为3分。着色深浅程度：没有着色记为0分（即为阴性），浅黄色记为1分（即为弱阳性），棕黄色记为2分（即为阳性），棕褐色记为3分（即为强阳性）。最后按照两者之间乘积加以统计分析，结果0分表示阴性，1、2分表示+，3、4分表示++，6、9分表示+++。 　　1.6 统计学处理 　　所得数据采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析，通过多个独立样本对比Kruskal-Walli