Western-Blot-protocol实验步骤.docVIP

Western Blot protocol 主要试剂及缓冲液的配制1).?30%丙烯酰胺： 将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。 2).?10% SDS： 称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。3).10x蛋白电泳缓冲液： 30.2gTris、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml 4).20×转膜缓冲液： Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加水定容至1000ml 配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml) 5).1.5M Tris 8.8： （注意温度对tris PH值的影响） 18.15 g Tris 溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值8.8，定容至100ml。 高温灭菌后室温保存。 6).1M Tris 6.8： 12.11g Tris 溶于80ml 超纯水，加浓盐酸调PH值6.8，定容至100ml。 高温灭菌后室温保存。 7). 10×PBS： NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H2O 35.85g，KH2PO4 2.4g，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000ml 8). 1xPBST(0.05% Tween 20)： 10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul 9).10%（W/V）过硫酸铵： 临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯水，4度冰箱保存3天10).?丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)： ，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯水 38ml 11).?封闭液： 5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。 12) Stripping buffer (BME 800ul，SDS 2g，TRIS 0.756g，HCl调pH至6.7，加水定容至100ml) 操作步骤 蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。弃培基，用5ml PBS清洗一遍，加入1 ml PBS用细胞刮将细胞挂下，移入2 ml EP管中，（将平板对光观察， 可以判断细胞刮下的完全度），可以用1ml PBS清洗一遍，将清洗液一并转入2ml EP管中。4000rmp离心1分钟。弃上清，以100ul PBS重悬沉淀，加入100ul 2×loading buffer。将EP管置于金属浴中99℃处理10min（热处理管盖会崩开，在管盖上压一个重物）。置于冰上准备上样，或是-20度保存。按照之前的蛋白定量结果，10cm平板大约能提取450-600ug蛋白。 配胶和上样电泳 1).配胶前先将玻璃板、梳子和电泳仪等洗干净，并将玻璃板晾干。 2). 根据所检测蛋白的大小并参照表1选择丙烯酰胺的浓度，再根据表2配方配制分离胶。配制分离胶时要混合均匀并缓慢加入玻璃板里，注意分离胶与加样孔底间要留出1cm左右积层胶，用异丙醇封胶面。 表1 丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5 57-212 表2 （一块胶的用量） 分离胶 积层胶 8% 10% 12% 15% 5% ddH2O 2.27 1.93 1.6 1.1 1.40 30% PAGE 1.33 1.67 2.0 2.5 0.33 Tris.HCl 1.3（1.5M tris 8.8） 0.25 （1 M tris 6.8） 10%SDS 0.05 0.02 10% AP 0.05 0.02 TEMED 0.005 0.002 总体积 5ml 2ml 待分离胶凝后（约需15-30min，根据室内温度），倒掉ddH2O后，用滤纸条吸干水分。参照表2配制积层胶，到积层胶时尽量倒满（如果有些漏要及时补胶），插梳子前保证梳子的清洁。拔梳前，需要用刀片沿梳和玻板间隙划一次以除去玻璃板外的胶。待积层胶凝固后拔掉梳子，这时，若发现有上样孔歪斜，可以用注射器针头将上样孔调整好，之后将胶版装上电泳槽后，加上电泳缓冲液后待用，清洗时避免槽间隔异位。 3). 样品上样：蛋白样品临上样前，13000rpm、1分钟高速离心，上样时取上清。80V电压跑浓缩胶，120V跑分离胶。参考marker条带，到相应位置时停止电泳。 上样品左右两边如果有空余泳道，可加等体积的1×上样缓冲液，这样跑出来的胶好看。 2.转膜（半干转，整个操作中戴手套，不要用手触膜） ①在电泳过程中，剪好与分离胶等大的滤纸10张和PVDF膜1张（国产电泳仪分离胶大小约为8.5cm×5.5cm）；配transfe