第七章 发酵工程在现代生物技术中的应用 第一节 基因工程菌发酵 第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌.pptVIP

二、培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌 分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。 不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法 加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。 发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长 T总=t1+t2+t3 式中t1、t2、t3分别为加热、维持、冷却所需要的时间 其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。 发酵工程在现代生物技术中的应用 生物技术：应用自然学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将生物物料进行加工以提供产品和为社会服务的技术。 20世纪70年代以后，以DNA重组技术的建立为标志，形成了一个以基因工程为主导，发酵工程为中心，包括细胞工程和酶工程的现代生物技术体系。 第一节 基因工程菌发酵 一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，借助载体将重组的目的基因转移新的宿主细胞体系，并使目的基因在新的宿主体系细胞中进行复制扩增和表达所需的目的产物。 基因工程菌的制备 一、目的基因的制备 1.鸟枪法 选用合适的内切酶，在Mg2+的激活下，切开供体DNA链获得目的基因，根据酶切末端特点分为a、b两类。 基因工程菌的制备 2.cDNA法 又称反转录法，从细胞内提取目的基因的mRNA，在反转录酶的作用下，以mRNA反转录互补的cDNA。 3.人工合成 在电脑控制下通过合成仪合成获得的DNA片段。 二、载体的准备 目前常用的基因克隆载体： 1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒 2.pBR322和pUC：去除原有质粒的非必须功能，引入选择标记和在适宜的位置设置限制酶单一切点。 3.噬菌体载体 有λ噬菌体和M13噬菌体 三、基因与载体的连接 外源DNA与载体DNA之间连接方式： 1.粘性末端连接 先用一种酶切割外源DNA并将拟插入的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用同一种酶去切载体DNA，这样可以通过粘性末端连接起来。 2.平末端连接 3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末端的3 ′-OH上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个DNA片段的3 ′-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片段的3 ′-OH 末端上一定添加与T互补的寡聚A。 四、目的基因导入受体细胞 取决于是否用合适的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法 2、干热灭菌法 进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃，1～1.5h。 实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。 湿热灭菌法 利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。 其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温度升高10 ℃时，灭菌速度常数可增加8～10倍，对营养细胞更高。 蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为121 ℃，30 min。 湿热灭菌法 煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。 巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。 湿热灭菌法 间歇灭菌法　 反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1h；同上重复三次…　 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。 湿热灭菌法 高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽