植物组织培养和生物反应器.pptVIP

红豆杉细胞培养生产紫杉醇 BY 孔华庭 按美国国立癌症研究所制订的抗肿瘤休外和体内筛选方案，对紫杉醉的抗肿瘤活性进行了试验，在离体培养的细胞中加入2.5mmol/L紫杉醇可抑制Hela细胞生长；对KB细胞和L1210集落形成的抑制强度超过长春碱与秋水仙碱。。。。。 紫杉醇的抗癌机理 紫杉醇是一种抗微管药物，为细胞有丝分裂抑制剂或纺锤体毒物。这种作用对于迅速分裂的肿瘤细胞，可以导致肿瘤细胞在有丝分裂时，不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制细胞分裂和增殖，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直到死亡。体外研究证明，紫杉醉以浓度依赖性方式可逆地结合到N端微管蛋白的p亚单位上，增加聚合的速率和产量。紫杉醉能抑制有丝分裂时所必需的微管网的正常再生，防止纺锤体形成，导致染色体的断裂并抑制细胞复制和移行。 天然提取紫杉醇 紫杉醇最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的，后来人们对其他红豆杉属植物的各部位包括针叶、嫩枝、树皮及心材中的紫杉醉含量进行了分析，发现树皮巾含量最局，枝叶次之，心材最低。因此从针叶中提取紫杉醉引起人们足够的重视。即使针阶中紫杉醇含量稍低但其产量与树皮相当，因针叶的总量是树皮的2—4倍，而且针叶的再生力强，采集后对树的生命无太大的影响，不会造成生态环境的破坏。由于多种红豆杉桓株的小枝及针叶中紫杉醇含量与树皮相近，因此可采用人工培栽大量的红豆杉桓株，利用从这些栽培植抹上馅剪下的小枝条及针叶提取紫杉醇。 红豆杉愈伤组织诱导 植物体是一个有复杂结构的多细胞系统，植物体中的不同组织及组成组织的不同细胞，均是以高度的协调方式在发挥作用。一个有结构的器官或组织，如根、茎或叶等，将它与母体分离及培养在含有适当激素的培养基里时，就可能转变为一种能迅速增殖的细胞团，即愈伤组织。 影响愈伤组织诱导的因素 因素一：外植体的选择。目前几乎已从所有红豆杉中诱导出愈伤组织。大量实验结果表明，幼茎是最合适的外植体。大部分愈伤组织呈浅黄色，易碎。从红豆杉的针叶也可诱导出愈伤组织，但生长速度在早期较坦，这可能与针叶中相对较小比例的分生组织和薄型组织有关，其他几种红豆杉中诱导愈伤组织的实验也都表明，幼茎是诱导愈伤组织最合适的外植体。 因素二： 植物生长调节物质。激素成分的加入对愈伤组织的诱导极为重要。在通常情况下，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的高速生长是必需的，特别是当细胞分裂素与生长素联合应用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成，最常使用的生长京是IAA、NAA和2，4—D，最常用的细胞分裂素是激动素(KT)和六苄氨基嘌呤(6BA)。 因素三：诱导条件。在红豆杉的组织培养中，适宜于诱导愈伤组织的温度为20℃一26‘c。愈伤组织在黑暗和光照下都可被诱导，但光照下诱导率低，形成量少。 红豆杉愈伤组织诱导培养基的优化 有研究者曾把愈伤组织状态的变化明确地列成数轴表示，数轴上标记的是典型的不同类型的愈伤组织任何愈伤组织类型基本上都可以在数轴上找到相应的位置。组织培养实际上就是按需要调控这些类型的愈伤组织间的相互转化。Se是指细胞处在胚性状态时的值，高于它时愈伤组织就会旺长，低于它时就会分化。从大量培养来讲，se值高时细胞分裂快、生长好，低时则产生次生代谢物的能力强。因为任何培养物按其主要特征都可以在图3—2所示的数轴上找到位置，所以无论对所培养的组织细胞是否熟悉，无论所选的培养基是否合适，理论上按照模型和对外界因子(植物激素、氮源、无机离子及维生素、碳源、渗透压、物理因素)的认识都可对培养物进行调控，使之朝所需方向或位置移动。 试验中，通过状态调控把琉松愈伤组织转变为致密愈伤组织颗粒，转变后的愈伤组织内部有一定程度的分化，如管状分子的出现，每个颗粒可看作是一个有机整体，这些类似于有机体的颗粒中的分化结构可能为营养和代谢物质的输送提供通道，而且这种有效的物质传递通道不同于人工固定化的植物细胞颗粒，它只在具有一定结构的植物组织中存在。因此，致密愈伤组织颗粒能积累较多的次生代谢产物紫杉醇。 添加抗褐变剂 在红豆杉愈伤组织诱导及继代培养过程中，常常会发生细胞褐变的现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重则导致细胞死亡。如何减轻或控制褐变的发生，是红豆杉组织培养中重要的研究内容。红豆杉培养细胞发生褐变的原因复杂，与材料的基因型和生理状态、培养基成分和激累配比等因素有关。因此，要防止褐变发生，减轻褐变危害，除了要选择合适的外植体、培养基和适宜的激家组合外，添加抗褐变剂是较为方便有效的常规手段。 活性炭（AC） 水解乳蛋白（LH） 植酸（PA） 高产细胞系的建立 适宜工业化生产的细胞系条件：一是分散性好，适于工业化操作；二是均一性好，细胞形状大小大致相同．甚至在生理生化状态上同步；三是生长迅速；四是细胞中次生产物含量高；五是细胞