宜昌橙体细胞染色体45SrDNA荧光原位杂交分析.docVIP

宜昌橙体细胞染色体45SrDNA荧光原位杂交分析 　　摘要: 【目的】 为了初步探讨宜昌橙（Citrus ichangensis Swingle）体细胞染色体联会发生的机制，【方法】以中国农业科学院国家种质重庆柑橘圃（CRICAAS）提供的宜昌橙为试验材料，利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization， FISH）研究了其体细胞有丝分裂中期染色体上45S rDNA的分布情况，并结合联会区域比较分析。【结果】结果表明，不同类型宜昌橙细胞分裂中期染色体45SrDNA的分布位点无明显差异，均存在4个杂交位点，分别位于第2对同源染色体的短臂端部或者近端部，及第9对染色体的次缢痕区域。【结论】宜昌橙体细胞染色体联会现象并非随机生物现象，而是宜昌橙固有的细胞学特征；其体细胞染色体联会以同源染色体联会为主，推测可能与异染色质集中区域或者结构形成有关。 　　关键词: 宜昌橙； 体细胞； 染色体联会； 荧光原位杂交； 异染色质 　　中图分类号：Ｓ６６6．4 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－985－０5 　　宜昌橙为（Citrus ichangensis）为芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）常绿果树，具抗寒性强、耐贫瘠、矮化，且具有适应性广和抗病性强（尤其是柑橘溃疡病）特点，是非常宝贵的柑橘种质资源和砧木材料，目前对宜昌橙的研究集中在起源、地理分布、砧木利用以及生理特性方面，而对其细胞学研究则相对较少。 　　染色体在细胞分裂期配对（chromosome pairing），或者称联会（synapsis）往往是生物体形成配子的减数分裂特有现象，是减数分裂的重要特征。Overton[1]和Metz[2]分别于1909和1916年报道了体细胞染色体联会现象。根据体细胞有丝分裂中期和间期染色体距离的测量结果分析，有学者认为某些动物和植物体细胞中同源染色体位置常常是非随机的相互靠近，并称此现象为体细胞同源染色体配对（somatic pairing），也称为体细胞联合或者联会（somatic association or synapsis）[3]。该领域以往的研究多数是停留在染色体相互靠近这一表面现象的描述和统计，关于染色质或者染色体丝的真正连接和可能发生的基因重组和遗传物质的交换以及联会的机制方面的研究也只是在少数物种中有所涉及。 　　前期研究发??宜昌橙是体细胞染色体联会很好的材料，不仅可清晰的观察到染色体质或丝之间的连接，且经过初步统计，联会频率达27.1%～40.2%，这为进一步深入研究其联会发生的染色体区域、染色体类型和联会机制创造了重要前提条件。我们从细胞学角度，利用45S rDNA荧光原位杂交技术（（fluorescence in situ hybridization， FISH）对宜昌橙体细胞有丝分裂中期的染色体进行观察和研究，分析了45S rDNA在染色体上的分布位点数目和分布区域，初步探讨了宜昌橙体细胞染色体联会发生的机制，为后续进一步的研究提供借鉴和参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.2 方法 　　1.2.2 45S rDNA-FISH分析 45S rDNA序列质粒由南开大学惠赠，质粒DNA提取采用北京鼎国的质粒快速提取试剂盒，检测DNA质量用0.8%琼脂糖凝胶电泳；探针（Roche公司）标记使用地高辛随机引物延伸法；原位杂交及杂交信号的检测参照Chen等[5]、Jiang等[6]及Kamstra等[7]的方法，稍作改动。主要包括染色体标本前处理，探针标记，封阻DNA制备，杂交缓冲液配制及杂交，洗脱及信号检测，镜检图像采集。其中染色体制片衬染试剂为DAPI，所激发的荧光为蓝色，抗体结合时均采用Anti-digoxingenin-fluorescein，所激发的荧光为绿色，为了便于图片分析，将衬染颜色模拟转换为红色，因此合成后在信号的区域则显示为黄绿色。 　　2 结果与分析 　　3 讨 论 　　3.1 45SrDNA与宜昌橙体细胞染色体联会 　　通过分析45SrDNA在染色体分布的数目和定位的位置，可以很好地用于鉴别染色体，同时在系统发育学和物种亲缘关系研究中也是一项很重要的依据。45SrDNA是高度串接重复序列，在基因组上有一对或者几对染色体具有此位点，在染色体上的物理位置具有一定的固定性，可以为研究基因组在分子和染色体水平上的进化提供线索[10]，可以有效地反映种、属间的分化程度[11]。通过FISH技术将45SrDNA在染色体上进行定位，可以为核型分析提供有效的细胞学标记，特别对于染色体较小且形态相近的物种[12]，并且对研究基因组间的关系、进化情况以及在基因组内区分染色体类型也具有重要意义[13]。 　　本文结合荧光原