酶切连接.pptVIP

典型的酶切反应步骤 去离子水 17-X uL 10X酶切缓冲液 2 uL DNA（0.2-5ug 溶于TE缓冲液） X uL 内切酶（1-5U/ugDNA)) 1 uL 总体积 20 uL 步骤 按水、缓冲液、DNA、酶的顺序加入EP管 轻轻摇匀，离心2秒 37度反应1-3小时 65度下作用10分钟，终止反应 电泳检测结果 基因枪 * * DNA限制酶切反应 一．DNA的限制酶反应 1. 酶单位定义: 使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反应类型 1) 完全酶切 2) 部分酶切 3. 酶切反应影响因素 1) DNA分子的组成 i. 碱基组成与排列方式 ii. 识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍 2) 反应条件 ???????????i. DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度） ii. 限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性：保存和反应 iii. 反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液， iv. 反应温度：大多数为37℃ v.?双酶切和多酶切反应 同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者--分别酶切。 i) 第一种酶切 电泳检查 酚/氯仿纯化 第二种酶切。 可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。 ii) 采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查 采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。 假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。 DNA 的 连 接 一. DNA的连接方法 两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构. 1)??同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 3) PCR产物与特定载体的连接（TA克隆） 4) 限制酶和其他方式产生的平整末端. 二. DNA的连接反应 1.?? 连接反应影响因素 当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关: 1)?连接反应系统中的总DNA浓度 2)?一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度, 该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化) 3)?两种不同DNA分子的浓度之比值. 2. 连接反应条件 1)?评估连接反应结果的方法 i.??琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化 2)?反应条件 转化技术 宿主细胞：大肠杆菌、枯草杆菌 …… 原核宿主 酵母菌 哺乳类细胞 ……真核宿主 昆虫细胞 转化方法：钙离子处理 电穿孔 基因枪 *