酶的测定.docVIP

一、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚比色法测定） 酶液的制取 称取0.5g鲜重叶片，加入1ml磷酸缓冲液（PH=7.8,0.05mol/L），冰浴研磨，研磨后再加入4ml磷酸缓冲液。将研磨液倒入离心管中，平衡。12000r/min、0-4℃下离心20min，上清液即为酶提取液。离心后冷藏保存。 POD: 取上清液20微升加入比色杯中（对照加20微升磷酸），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0，1，2min的OD值）。 反应液：PH＝6.0的磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28微升，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219微升混合保存于冰箱中。 POD活性=ΔA470*V/（a*W） V-酶液总体积（ml）；a-测定时酶液体积（ml）；W-样品重（g） 可溶性蛋白含量的测定 取上清夜20微升（对照加20微升水），加3ml考马斯亮蓝，放置2min后，马上于595mn下比色。 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=（C*V/a）/(W*1000) C-查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V-提取液总体积（ml）；a-测定所取提取液体积（ml）；W-取样量（g）。 可溶性蛋白含量（ug）：y=0.0061x0.0359（R2=0.9563） 二、多酚氧化酶（PPO）活性测定（比色法测定） PPO活性的测定参照李焕秀（1994）的方法进行改进。 一、原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如邻苯二酚（儿茶酚）和多巴。 二、材料：树皮韧皮部（分别在压条育苗前期、愈伤组织形成期、根原基形成期和不定根生长期进行取样） 三、仪器与用具：高速低温台式离心机；分光光度计；1mL 、5mL的移液管；5mL离心管；研钵；试管数支；10mL容量瓶；秒表；水浴锅； 四、试剂： 1、0.1mol·L-1，pH 6.0的磷酸柠檬酸缓冲液； 2、1%（10g/L）的邻苯二酚（1g用蒸馏水定容至100 mL）； 3、0.1%(1/L)的脯氨酸（0.1g（0.05）用蒸馏水定容至100 mL（50））； 4、石英砂； 五、方法步骤 1、酶液提取 取鲜样0. 5－1.0g, 加1 mL 磷酸柠檬酸缓冲液（0.1mol·L-1，pH 6.0），加少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆,加缓冲液9mL稀释（按100mg鲜重材料加1mL提取液的比例），使终体积为10mL（研完冰盘放回冰箱）。吸取匀浆于5mL离心管冷冻离心（0-4℃条件下4000rpm）20 min（上清液即为待测酶液），收集上清液保存在冷处，置于0-4℃下保存待用。 2、测定 反应体系试剂 用量（mL） 磷酸柠檬酸缓冲液 4.0 1%邻苯二酚 0.3 0.1%脯氨酸 0.2 取4支具塞试管（设3个重复，3支为样品管，1支为对照管），加入反应体系，吸取酶液1.5 mL（对照管加入1.5 mL蒸馏水）放入反应体系中，2min后在30℃恒温水浴上保温10 min，取出后4 min在721B型分光光度计460nm波长读取光密度值（读取0，2，4分钟，每2min读一个）。（做一个测一个） 3、计算 酶活力（ΔA/0.01 min·g）=E460/（0.01×W×t） 即酶活力是以每分钟每克鲜样光密度每增加0.01为一个酶活单位。 式中： W—样品鲜重（g） t—反应时间 缓冲液配制： A液：0.1mol·L-1柠檬酸溶液：19.21g用蒸馏水定容至1000 mL。 0.2mol·L-1柠檬酸溶液：3.842g用蒸馏水定容至100 mL。 B液：0.2 mol·L-1，Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4 ·12H2O 71.64g （7.164）用蒸馏水定容至1000 mL（100）。 0.1mol·L-1，pH 6.0的磷酸柠檬酸缓冲液；17.9 mL 的0.2mol·L-1A液+32.1 mL B液，稀释至100 mL。 三、吲哚乙酸氧化酶（IAA O）活性测定（比色法测定） IAAO活性的测定参照张志良（2003）的方法。 一、原理：吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要作用，而影响植物的生长。 酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。 二、材料：树皮韧皮部（分别在压条育苗前期、愈伤组织形成期、根原基形成期和不定根生长期进行取样） 三、仪器与用具：高速低温台式离心机；72型