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Znf268和慢性淋巴细胞白血病的关系 介绍cll以及肿瘤抗原技术 Serex技术在cll中的运用 试验的计划及展望 慢性淋巴细胞白血病 慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymPhocytic leukemia,Cll，简称慢淋)是淋巴细胞在体内异常增生和积蓄伴有免疫功能低下的疾病。由于慢淋患者淋巴细胞寿命极长，并经常伴有免疫反应缺陷，放又称“免疫无能淋巴细胞蓄积病”。临床上主要表现是以成熟淋巴细胞增多、淋巴结肿大为主，常伴有肝脾肿大、贫血及出血等症状，个别患者伴有皮肤损害。 该病的发生与电离辐射、各种化学性致癌物质或肿瘤病毒无关。目前发现遗传因素可能具有一定作用，慢淋有明显的家族史，同一家族内偶有数例慢淋发生，但确切的遗传方式未明。慢淋在西方国家是常见的一种白血病，在我国较少见，仅占白血病总数的1％一4％，是老年人白血病中较常见类型，约90％慢淋患者年龄＞50岁，男性多于女性。慢淋病程悬殊不—，短至1—2年，长至5—10年，甚至20年以上。一般年龄偏大，就诊前无症状，生存期亦长，预后也较好，否则较差。常见死亡原因为感染，尤以肺部感染多见。慢淋因急变死亡罕见。 肿瘤抗原技术的发展 肿瘤特异性淋巴细胞克隆 (ＣＴＬ克隆 )技术 ①建立肿瘤细胞系 ;②通过自体外周血Ｔ淋巴细胞与自体肿瘤细胞共同培养刺激特异性ＣＴＬ增殖 ;③通过有限稀释法建立ＣＴＬ克隆 ;④应用分子生物学技术建立肿瘤ｃＤＮＡ和患者ＨＬＡ 1类抗原分子的真核细胞共同表达载体 ;⑤应用肿瘤特异性ＣＴＬ筛选阳性克隆 ;⑥测定阳性ｃＤＮＡ序列 ,获得基因组序列 ,推导出肽序列 ;⑦人工合成肽序列 ,通过杀伤实验确定ＣＴＬ识别的短肽 重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术 (Serologic identification by recombinant expression cloning,ＳＥＲＥＸ ) Serex技术 .Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ小组于 1 995年首先建立了ＳＥＲＥＸ分析法 ,开创了血清学检测肿瘤抗原的新时代 .ＳＥＲＥＸ法的理论基础是人体Ｂ淋巴细胞可以识别自身肿瘤抗原 ,且部分抗原可以激发高价的ＩｇＧ反应 .ｃＤＮＡ表达文库的应用 ,使抗原浓度成百倍的增加 ,解决了既往肿瘤抗原抗体反应中的关键问题。 ＳＥＲＥＸ主要技术步骤 抽取新鲜肿瘤标本中的ＲＮＡ ,并纯化其中 ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ ,合成ｃＤＮＡ片段并转入ＺＡＰ表达载体,经过体外包装，一般可以获得106个菌斑。 应用患者血清扫描ｃＤＮＡ表达文库。将患者的血清经过大肠杆菌裂解产物吸收 ,最后将血清按照 1∶1 0 0稀释 ,把噬菌体斑扩增后转至硝化纤维膜上 ,经血清室温孵育 2 4小时后 ,应用碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧＦｃ抗体孵育 1小时 ,进行显色反应。阳性克隆再次扩增进行第二轮筛选 ＤＮＡ测序 反转录ＰＣＲ法检测阳性克隆在正常组织的表达。 应用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析阳性克隆ｍＲＮＡ的分子量 ,进一步证实阳性ｍＲＮＡ的存在 ＳＥＲＥＸ在肿瘤抗原中的应用 ＳＥＲＥＸ可识别已知的ＣＴＬ识别的抗原 SEREX可以发现新的肿瘤抗原，对研究液体免疫应答在抗肿瘤作用及其寻找新的肿瘤标记物都具有重要的意义。 通过SEREX技术鉴定和CLL相关性的抗原 选择5位没有经过治疗的病人，纯化CLL蛋白，建立CDNA文库。 CNDA克隆进入ZAP表达载体 用IPTG诱导表达，用25个CLL患者和5个淋巴瘤患者的血清进行免疫筛选。 测序，并将序列和公共数据库的已知基因进行比较。找到了14个抗原。 发现的14种抗原 RT－PCR以及NORTHERN BLOT 试验检测mRNA在正常人和cll患者、淋巴瘤患者中的表达。 蚀斑实验 通过序列分析发现有序列的不同剪接形式（alternative splicing): clones KW-1, KW-4, KW-6,KW-11, KW-13, and KW-14发现大部分的clones的序列经过剪接后意味着蛋白的功能的改变。 经过检测发现KW-4有两个不同的剪接形式: znf-268 缺失KRAB结构的znf-268 Znf268及缺失KRAB的znf268 RT-PCR分析两种剪接形式在组织的表达 Northern blot分析两种剪接形式在正常的组织和癌变组织中的表达 计划和展望 Western blot 致谢 * * 样品的收集 各类的白血病的外周血样 Western blot 正常血液作为阴性对照 以znf－268抗体来检测 有阳性反应或者 量的改变 原位杂交 RT-PCR 检查znf-