一种合成磁性物质微好氧细菌分离及高效半定量检测磁性物质方法建立.docVIP

一种合成磁性物质微好氧细菌分离及高效半定量检测磁性物质方法建立 　　基金项目：国家基础科学人才培养基金（J1030830），国家级大学生创新创业训练计划项目 　　摘要： 本文分离得到一种能产生磁性物质的细菌，并在某些方面与已报道的几种能产生磁性物质的细菌有所不同。由透射电子显微镜观 察，该细菌有一种与已知细菌构造明显不同的特殊结构。根据电磁感应加热的原理，我们利用电磁炉产生的高频交变磁场，建立了一种能快速，低成本，半定量检测磁性物质的方法，且该方法未见文献报道。由于本方法具有不需要复杂处理和不易受干扰的特点，尤其适用于半定量测定生物样本中磁性物质的含量。 　　关键词： 生物诱导矿化 电磁感应加热 磁性物质 微好氧细菌 　　生物合成磁性物质可以分为两种模式：生物控制矿化（biologically controlled mineralization， BCM）和生物诱导矿化（biologically induced mineralization， BIM）[1]。通过BCM，趋磁细菌（Magnetotactic bacteria）可以合成特有的磁性细胞器，即磁小体[2]，BCM也一般特指趋磁细菌的生物矿化过程。然而BIM可以在多种细菌中观察到，如Shewanella sps. [3]， Geobacter sps. [4]和Thermoanaerobacter sps. [5]等。经由BIM合成的磁性晶体通常在胞外，形状不规则，不成链状排列，无外膜包被，为直径约10-50 nm的超顺磁性颗粒。而磁小体在胞内，且形状规则，成链状排列，有外膜包被，形态和大小具有种属特异性[6]。对磁铁矿的微生物矿化的进一步研究将能加深对远古沉积物中微生物所起的地质作用的理解[1]。 　　虽然已经开发出了许多利用磁性颗粒的医药应用，尤其是磁小体，被认为是具有巨大应用前景的生物材料[7]。但是稳定可靠同时能大量获得磁性粒子的来源有限。为了能对产生相应磁性粒子的细菌优化培养条件或者能在诱变后筛选产量较高的菌株，需要对其在特定条件下产生磁性粒子的能力进行快速准确的评价。目前除了大规模培养后分离称重[8]和在透射显微镜（TEM）下计数等方法[9]，定量测定磁性粒子的方法十分有限。大规模培养称重为保证精度，每次测定需要消耗较多的培养基，且需要较多实验操作才能将磁性粒子分离出来。在透射显微镜（TEM）下计数测定??为磁性粒子的个数，所以不能准确的测定其中磁性粒子的含量，还需要人工计数一定数量的样本后才有统计学意义。虽然也能通过测定培养基中的铁含量变化间接估计磁性粒子产量[8]，但仍需要强酸使其溶解等样品制备操作，也需要原子吸收分光光度计等昂贵仪器。通过本文构建的测定方法，可以快速、低成本、半定量地估计生物材料中的磁性粒子含量，从而可以快速评价某一菌株产生磁性物质的能力，在相应的菌株优化等过程中发挥作用。 　　在高频交变磁场下，磁性粒子可被加热，根据这一原理设计的磁致肿瘤热疗可以定向地杀死癌细胞[10]。类似地，电磁炉在加热食物的过程中，通过产生高频交变磁场，在锅体中产热，这样产生的磁场应当也能加热磁性粒子，也具有易获得、成本低廉等优点。 　　本实验旨在分离出能合成磁性物质的细菌，并进行相关的研究，期间建立了简单、准确、可操作的测定磁性粒子产量的方法，目前尚未见文献报道。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株 由中山陵附近的小溪中自行分离得到，保存于中国药科大学微基因药物实验室，编号为ZS-3。 　　1.1.2 试剂 配制琼脂泥培养基的沉积物细粉为自制，琼脂粉购自Biosharp公司。其他试剂均为国产分析纯。 　　1.1.3 培养基 在分离过程中使用的培养基为琼脂泥培养基（每升蒸馏水中加入3 g沉积物细粉，3.8 g琼脂）。初步液体培养时使用淤泥抽提液。倾注平板用的培养基中琼脂量为0.68 %。进一步培养时向淤泥抽提液中加入0.02 mmol /L FeCl3，0.02 mmol /L奎尼酸，0.5 g /L K2HSO4，0.05 g /L巯基乙酸钠，0.4 g /L NH4Cl和2 ml /L 60 %乳酸钠[11]，并注入4 %的氮气。具体的氮气充入方法详见2.2.2。 　　1.1.4 仪器 GHX-9080B-2型培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；灭菌锅（北京金海鑫压力容器制造有限公司）；TG16-W型微量高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；JJ-CJ-1FD型超净台（苏州市金净净化设备科技有限公司）；752型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；JYC-19BE5型电磁炉（九阳小家电有限公司）；透射电子显微镜（株式会社日立制作所）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 采样与富集 该方法与一种采样与富集趋