第四章 病毒抗原与抗体检测技术PPT课件.ppt

第二节 酶免疫技术 固相载体 塑料制品 微粒 膜载体 NC膜、尼龙膜 第二节 酶免疫技术 包被与封闭 包被 适宜浓度蛋白质 封闭 二次包被填补空隙 小牛血清 二、酶联免疫吸附试验 Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA 酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。 间接法 检测抗体 + + + 固相抗原 标本 酶标抗体 底物 显色 双抗体夹心法 检测抗原 + + + 固相抗体 标本 酶标抗体 底物 显色 竞争法 可检测抗原、抗体 YYY + YYY + YYY 参考管 酶标抗原 YYY + YYY + YYY 待测管 酶标抗原 抗原 捕获法 检测IgM抗体 + + + 抗IgM 标本 抗原 酶标抗体 显色 （含IgM） + 三、免疫酶染色试验 Immunoenzymatic staining test IEST 酶标抗体（抗原）—抗原（抗体）复合物 底物 有色底物 三、免疫酶染色试验 细胞免疫酶染色 均相酶免疫测定——无需分离游离与结合的酶标记物 酶标记物结合后改变酶活性 非均相酶免疫测定—需分离游离与结合的酶标记物 液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物 固相：ELISA 第三节 放射免疫技术 Radioimmunoassay RIA 利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析 放射免疫 核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体 免疫放射 核素标记抗体结合待测抗原 R.S. Yalow 第三节 放射免疫技术 125I、131I、3H、14C 标记 纯化 鉴定 放射性 免疫活性 第三节 放射免疫技术 第三节 放射免疫技术 放射免疫 竞争法 + + + + + + + + Bound Free Ag Ab 6/8=0.75 4/8=0.5 2/8=0.25 1/8=0.125 B/B+F 第三节 放射免疫技术 放射免疫 以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应 曲线 第四节 血清学试验 中和试验 血凝/血凝抑制试验 补体结合试验 一、中和试验 neutralization test 体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。 中和抗体 一、中和试验 （一）原理 中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。 当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。 一、中和试验 （二）方法步骤 病毒---已知滴度，并有感染力 测滴度：细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细胞或动物，观察CPE或动物感染情况，确定滴定终点以CCID50或LD50表示 标准病毒试验浓度：100 CCID50/单位体积或100 LD50/单位体积 一、中和试验 抗体 用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察CPE。 病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。 抗体滴度的含义：抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。 一、中和试验 举例 如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时，0.1ml抗血清含有1个抗体单位。 请问： 1：160及1：40含有几个抗体单位？ 标准抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml 一、中和试验 宿主 细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用） 鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV） 动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒 一、中和试验 （二）方法步骤 固定血清—稀释抗病毒法 检测病毒及其滴度 固定病毒—稀释抗血清法 检测血清效价 一、中和试验 （二）方法步骤 固定血清—稀释病毒法 用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清(2