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生物等效高效液相方法学确证
研究方法是根据研究目的和研究条件确定的,没有一种方法永远优于其他方法。 方法学确证的意义 找到符合研究要求的最佳研究方法,提高研究效率,保障研究结果科学可靠。 方法学考察 特异性 精密度与准确度 样品稳定性 提取回收率 标准曲线和定量范围 定量下限 特异性 分析方法能够准确、专一测定分析物 的能力。要求分析物的测定不会被代谢物 或内源性物质干扰,要确保分析方法的最 佳检测条件。色谱法要考察6 个不同个体 的空白样品和空白样品加了对照物的色谱 图。LC-MS方法要考察分析过程中的介质 效应。 精密度与准确度 样品稳定性 提取回收率 标准曲线和定量范围 定量下限 定量下限是标准曲线上的最低浓度点,表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3~5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10~1/20的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20%。至少应由5个标准样品测试结果证明。 只有通过方法学考察才能证明研究方 法是否稳定可靠,方法学确证是研究工作 能否顺利进行的关键。 * * 方法学确证 精密度是指相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用批内和披间的相对标准差(RSD)来考察。一般RSD应小于15%,在LLOQ附近RSD应小于20%。 准确度是指测得生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即样品的实测浓度与真实浓度的偏差)。一般在85%~115%范围内。在LLOQ附近应在80%~120%范围内。 要求选择高、中、低三个浓度的样品进行考察。低浓度通常选在LLOQ的3倍以内,高浓度接近标准曲线的上限。批内考察时,每个浓度至少制备并测定5个样品,批间考察应在不同天连续制备并测定,至少有连续3个分析批(不少于45个样品)的结果合格。 对样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行考察,以确定样品的存放条件和存放时间。还应注意考察储备液的稳定性和以及样品处理后溶液中分析物的稳定性,确保生物样品在稳定的条件下进行测定,保证检测结果的准确性和重现性。 从生物样本基质中回收得到分析物的响应值除以标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出来供分析的比例。考察高、中、低三种浓度的回收率,结果应精密并具可重现性。 标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系,一般用回归分析法(如用加权最小二乘法等)所得的回归方程来评价。标准曲线高低浓度范围为定量范围,在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。必须至少用6个浓度建立标准曲线,对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围,不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品,但计算时不包括该点,仅用于评价干扰。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。 *
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