医学类第五组利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体青蒿酸课件.ppt

利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸 选用这篇文章的原因： 符合微生物发酵的主题，且综合分子生物学、微生物学、细胞生物学等学科 大部分为我们所学的知识：生化中的甲羟戊酸途径；分子生物学实验手段等等 实验思路简单明了，充分体现对知识的灵活运用 实验结果影响深刻，将会对疟疾治疗带来一场革命 一、疟疾 俗称“打摆子”，是一种由疟原虫（疟原虫属，Plasmodium spp.是一类单细胞真核生物，属于细胞内寄生虫）造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病。 疟原虫的生命周期很复杂。通过蚊子叮咬进入宿主体内後首先侵入肝脏细胞，再由肝脏进入血液感染红血球，在红血球内无性繁殖扩增之後，受外部环境因素的影响，它们可以继续感染新的红血球，也可能形成配子体（gametocyte），当蚊子吸取受感染的血液後，雄、雌配子体进入蚊子胃内发育成配子并进行有性生殖，合子最终在胃壁下形成卵囊（oocyte）。卵囊中疟原虫进行无性繁殖，最终形成孢子体（sporozoite）进入蚊子唾液腺，准备感染新的脊椎动物宿主。 疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为人们关注，但是在非洲，平均每30秒就有一名儿童死于疟疾。 世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在3亿到5亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一到三百万之间, 这其中大部分为儿童。 由于传播疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium?falciparum）具有复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是唯一的选择。而抗药疟原虫突变系Plasmodium falciparum2,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。  而青蒿素，一种由我国学者在20世纪70年代初从Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），通过释放高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望”。  人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素药物的生产主要依靠我国从野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%??w/w),且受地域性种植影响较大。目前使用青蒿素进行治疗每个疗程的费用是８美元到１５美元，对于受疟疾危害最深的非洲和南美地区的贫困患者来说过于昂贵。  基于这些因素，科学家们开始尝试利用基因工程手段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“青蒿素计划”，由美国加利福尼亚大学伯克利分校的生化工程师Jay??Keasling 主持，并且起初就获得“比尔-梅琳达盖茨基金会”4260??万美元的资助。  2006??年，Keasling??等宣布，通过合成生物学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以产生高水平的青蒿酸（artemisinic??acid）——青蒿素的一种直接的前体。 该成果发表于2006年4月13日英国《自然》杂志上，题为“Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast” 但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍，而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、高效的。 真核 糖酵解 甲羟戊酸途径 真核 糖酵解 甲羟戊酸途径 研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的： 由于酵母也可以合成FPP，所以我们所需要做的只是将FPP到Amorphadiene再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。 为了将流程图转为现实，我们对酵母细胞进行了总共8次的基因工程改造。  第一步，为了能让酵母细胞合成Amorphadiene，我们将ADS基因插入由GAL1 启动子控制转录的pRS425质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入ADS基因的酵母只合成少量的amorphadiene。如图中菌株EPY201，4.4mg/L 。 而细胞中与amorphadiene 的量最直接相关的就是FPP的量，所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径）进行了总共5次的基因工程改造。 几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的 。具体过程如下： 首先，将一种截短的水溶性酶3-