高级生化试验实验一蛋白定量分析.pptVIP

分光光度计是一种靠光栅或棱镜提供单色光，利用分光光度技术基本原理进行物质浓度测定的仪器。它不仅能在可见光区测定有色物质的吸收光谱，而且也能在紫外光区和红外光区测定无色物质的吸收光谱。 实 验 一 蛋白质的吸光分析测定 掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤。 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。 本次实验目的 蛋白质是生物体的重要组成成分，也是生命活动的主要物质基础。 蛋白质含量测定是各基础和临床学科的基本实验手段。 根据蛋白质的物理、化学或者生物学特性可以测定其含量。 目前常用的是比色法和紫外分光光度法。 利用吸光分析法进行蛋白质定量测定 1.改良Lowry比色法（Hartree法） 2.考马斯（Coomassie）亮蓝结合法 3.紫外分光光度法 本次实验内容 1.有色物质对可见光有选择性吸收作用；一些无色溶液对可见光无吸收作用，但其所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。 2.不同物质由于分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同。因此每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。 吸光分析法的原理 — 利用吸收光谱鉴定化合物 利用分光光度计绘制吸收光谱曲线 用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。 如何定性？ 每种物质有其特征性的吸收光谱 胡萝卜素蛋白复合物室温吸收光谱 1. 朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 LgI0/I=KL I0 :入射光强度； I :透射光强度；L ：介质厚度 K：吸光系数 — Lambert - Beer定律 如何定量？ 2．比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 LgI0/I=KC I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数 3.Lambert-beer’s law 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 A= -lgT= -lg I/ I 0 =KCL A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度； T：透光度（ I/I0） K：即吸光系数，是指当溶液浓度为1mol/L,光程(溶液厚 度)为1cm时的吸光度。 ① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符。 ② 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰。 ③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。 应用中注意的问题 空白管： 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。 计算 （1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准/A样品= KC标准/ KC样品 C样品=A样品/A标准×C标准 A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L：液层厚度 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。 （2）标准曲线法 标准曲线使用注意事项 ①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ②吸光度在0.05-1.0范围内。 ③所作标准曲线仅供短期使用。 ④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。 一．分光光度计基本部件 1．光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氘灯。 在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨灯；在紫外光区，多使用氘灯。 2．单色器 棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。 3．吸收池（比色皿、比色池） 选