海藻酸钠固定化α—淀粉酶研究.docVIP

海藻酸钠固定化α—淀粉酶研究 　　摘要：以海藻酸钠为载体，采用包埋交联法制备固定化α-淀粉酶，通过单因素试验和正交试验确定最优的固定化α-淀粉酶的条件。利用聚乙二醇4 000作为制孔剂，进一步制备具有多孔结构的固定化酶。结果表明，最优工艺为海藻酸钠1.6%，α-淀粉酶0.4%，羧甲基纤维素钠0.2%，CaCl2 2%，在此条件下，固定化α-淀粉酶的固定效率可达92.43%。在体系中添加浓度为2.5%的聚乙二醇4 000能使酶活性提高37.61个百分点，得到的固定化酶的温度稳定性以及pH稳定性均优于游离酶。 　　关键词：海藻酸钠；固定化；α-淀粉酶；聚乙二醇 　　中图分类号：Q814.2；TQ925+.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5845-05 　　α-淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍存在于动物、植物和微生物中，它能以随机作用的方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1，4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被广泛应用于食品加工、粮食工业、乙醇工业、发酵和纺织业等多种行业，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[1，2]。 　　固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是食品、医药、化工等领域的研究热点之一[3，4]。依据酶的性质和用途，酶的固定化方法主要可以分为以下4种：吸附法、交联法、包埋法和共价结合法[5]。 　　酶的固定化可以使用多种载体，其中海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，它是由β-（1，4）-D-甘露糖醛酸和α-（1，4）-L-古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材与载体材料，也常被用作固定化酶的载体[6]。聚乙二醇是一种无毒的高分子聚合物，与水有极好的互溶性，它的相对分子质量可从几千到几万，控制其相对分子质量的大小以及用量，可调节海藻酸钙中孔的尺寸、体积和密度[7]。以聚乙二醇为海藻酸钠制孔剂，两者在水溶液中形成均一体系，将两者混入氯化钙溶液中时，海藻酸钠转化为交联的网状大分子，海藻酸钙形成固态，聚乙二醇可以从固态的海藻酸钙中溶出，即形成多孔结构的海藻酸钙。当聚乙二醇相对分子质量为4 000时，海藻酸钙支架中可形成蓬松均匀的多孔结构，适用于组织工程多孔材料的应用[8]。 　　本试验采用海藻酸钠包埋交联法制备固定化α-淀粉酶，得到最佳的固定效果，并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了比较。采用聚乙二醇作为制孔剂，为进一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性，提高α-淀粉酶的酶学性能提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与材料 　　试验于2013年5月在武汉工程大学完成。 　　AL204型电子分析天平（METTLER TOLEDO）；722S型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；81-1型加热磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；DSHZ-300型多用途水浴恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。 　　试验中使用的α-淀粉酶购自北京双旋微生物培养基制品厂；聚乙二醇4 000购自BIOSHARP公司。其余试剂均购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。试剂纯度均为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 淀粉溶液多糖含量标准曲线的绘制 用DNS法标定淀粉溶液中的多糖含量[9]。分别取40、60、80、100、120 μL 2%淀粉溶液（m/V，下同），计算多糖含量，加入1.0 mL稀碘液，用蒸馏水定容至10 mL，混合均匀后在600 nm波长下比色。以吸光度值为纵坐标，对应多糖含量为横坐标，绘制标准曲线并列出线性回归方程。 　　1.2.2 α-淀粉酶的固定化 取4 mL 4%海藻酸钠溶液（m/V，下同），1 mL 2%羧甲基纤维素钠（以下简称CMC）溶液（m/V，下同），2 mL 2% α-淀粉酶溶液，用蒸馏水定容至10 mL，置于磁力搅拌器上混合均匀，用5 mL注射器吸取上述混合液，以10 cm左右的高度逐滴滴入含有0.4%戊二醛的2%氯化钙溶液（m/V，下同）中，固定0.5 h后滤出小球，用蒸馏水洗涤2～3次，储存于4 ℃冰箱中备用[10]。 　　1.2.3 α-淀粉酶活力的测定 以200 μL 2%淀粉溶液为底物，加入100 μL pH 6.0的1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，400 μL蒸馏水，300 μL适当稀释的α-淀粉酶溶液，于60 ℃水浴锅中准确反应15 min，立即加入1.0 mL 0.1 mol/L盐酸终止反应。从中吸取1.0 mL反应液，加1.0 mL稀碘液，用蒸馏