牛肠道病毒RT—PCR检测方法建立及初步应用.docVIP

牛肠道病毒RT—PCR检测方法建立及初步应用 　　摘要：参照GenBank中登录的牛肠道病毒（BEV）全基因组序列，针对其3D基因设计合成了1对特异性引物，提取病毒RNA，逆转录为cDNA，进行PCR扩增，经条件优化，建立了BEV的RT-PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示，该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段；且对牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BCoV）等相关病毒均无交叉反应；其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测，21份为阳性，阳性检出率为25%。 　　关键词：牛肠道病毒；3D基因；RT-PCR；检测 　　中图分类号：S852.65+3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0013-04 　　牛肠道病毒（Bovine enterovirus， BEV）属于小RNA病毒科、肠道病毒属，呈球形，大小为25～30 nm，是无囊膜单股正链RNA病毒[1]。自1959年Moll和Davis[2]首次分离到BEV以来，很多国家和地区先后报道了牛肠道病毒的感染情况[3～5]。肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，可以从患肠道疾病、肺炎、呼吸系统疾病和生殖障碍疾病的牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正常牛的粪便样品中分离，还存在于牛粪便污染的环境或水体中，常作为粪便污染指示剂[6]。 　　据研究报道，牛肠道病毒在国外牛群中的阳性率约为17.6%～80%[7]，而在我国，有关此病的病原学及流行病学调查的报道很少。近年来，山东省周边某些牛场发生了以水样和血便等严重腹泻为特征的疾病，致使奶牛的食欲和产奶量大幅下降。本研究结合本实验室分离获得的牛肠道病毒基因和GenBank登录的牛肠道病毒全基因组序列，针对其3D基因的相对保守区域，设计1对特异性引物，建立了牛肠道病毒的RT-PCR检测方法，并初步应用于临床送检样本的检测，具有较好的敏感性和特异性，为国内牛肠道病毒的临床检测及流行病学监测提供了有力支持。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1毒株和样品来源病料样品为山东省某牛场发生腹泻症状的病牛粪便。BVDV Oregon C24V 病毒株购自中国兽医药品监察所；牛肠道病毒（BEV）、牛传染性鼻气管炎??毒（IBRV）、牛轮状病毒（BRV）、牛冠状病毒（BcoV）、MDBK正常细胞等均由山东省农业科学院奶牛研究中心保存。临床组织样品来自牛场送检的疑似发病样品，共84份，主要包括血液、粪便、淋巴结、肠等。 　　1.1.2主要试剂生理盐水、青霉素、链霉素购自Hyclone公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP、RNA酶抑制剂、DNA Marker DL2000购自宝生物工程（大连） 有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1引物的设计与合成根据GenBank已登录的BEV K2577株（AF123432）、SL305株（AF123433）、VG-5-27株（NC_001859）等毒株的全序列，分析BEV 3D基因的保守区，设计引物BEVF：5′GAGCCCAGTGTTTTCTTTGATGTTTTC3′和BEVR： 5′AAAGTTGATCAATAAAGTGCTTGCA3′，扩增片段大小为732 bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，稀释成20 μmol/L，-20℃保存。 　　1.2.2病料处理将病料按1∶5加入灭菌生理盐水研磨，经反复冻融后，按每毫升加入青霉素、链霉素各1 000单位，以3 000 r/min离心20 min，取上清液用于试验或-70℃保存备用。 　　1.2.3病毒RNA的提取取200 μl病料处理液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书进行操作。 　　1.2.4反转录合成cDNA将提取的RNA按照 TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行反转录合成cDNA。 　　1.2.5RT-PCR检测方法的建立以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR 反应体系（模板、酶、引物、镁离子、dNTPs的浓度）、反应条件（变性、退火、延伸的温度及循环次数）进行调整优化，确定最佳PCR反应条件。 　　1.2.6RT-PCR 特异性试验应用建立的RT-PCR方法分别对BEV、BVDV、IBRV、BCoV、BRV、MDB