甜荞半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因克隆和序列结构分析.docVIP

甜荞半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因克隆和序列结构分析 　　摘要：同源克隆结合RACE（Ropid amplification of cDNA ends）技术，从甜荞（Fagopyrum esculentum）花芽中克隆到了半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列（GenBank登录号为JN605352）。结果表明，其cDNA全长1 298 bp，包括1个编码362个氨基酸共1 089 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF）。其蛋白与拟南芥中木瓜蛋白酶GCP1的同源性最高，属半胱氨酸蛋白酶家族中的木瓜蛋白酶亚家族，有1个由22个氨基酸残基组成的信号肽、1个由100个氨基酸残基组成的前体肽和1个由Cys149-His285-Asn305木瓜蛋白酶家族保守的催化三联体活性位点。 　　关键词：甜荞（Fagopyrum esculentum）；半胱氨酸蛋白酶；FaRDL基因；克隆 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）22-5609-03 　　半胱氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理生化过程[1]。许多研究表明，木瓜蛋白酶（Papain）是半胱氨酸蛋白酶中一个大的亚家族，主要参与植物对逆境胁迫的响应、疾病防御、抵制衰老以及细胞的程序性死亡过程[2，3]。甜荞（Fagopyrum esculentum）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）药食同源的经济作物，有很高的营养价值和保健功效，市场开发前景广阔。我国甜荞种质资源丰富，主要在我国西北部干旱瘠薄地种植，但其资源的开发和利用与其他甜荞主要生产国仍有较大的差距[4，5]。本研究探讨了甜荞木瓜蛋白酶的结构和功能，对深入研究这一旱区杂粮作物的生产应用有着重要的理论意义和生产价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　2011年4月选取温室干旱处理的甜荞品种北早生的新鲜花芽作为受试材料。 　　1.2 总RNA的提取和cDNA的合成 　　用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取甜荞花芽总RNA，并用M-MLuV逆转录酶[宝生物工程（大连）有限公司]合成第一链cDNA，反应体系和操作均按说明书进行。 　　1.3 甜荞半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的克隆 　　1.3.1 核心片断的克隆 根据GenBank中植物的木瓜蛋白酶基因序列，设计上、下游引物FaF（5′-TGTGGTAGTTGCTGGGCATTTC-3′）和FaR（5′-CCACGAGTTCTTCACAATCCAG-3′），PCR扩增克隆克隆FaRDL基因核心片断。 　　1.3.2 3′-RACE PCR扩增 根据获取的基因核心片断设计3′-RACE引物（5′-ACCGGCAACATGACC TCACTATC-3′），使用3′-full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]进行FaRDL基因3′端的克隆。 　　1.3.3 5′-RACE PCR扩增 根据获得的3′-RACE序列，设计5′-RACE引物FaGSP1（5′-AT CCAGTAGTCCACGCCGTTGTC-3′）和FaGSP2（5′-TCAAATCCGTCAATGCTCACAAC-3′），使用5′-full RACE Kit试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]进行FaRDL基因的5′端克隆。 　　1.3.4 验证拼接序列的真实性和基因全长cDNA的克隆 根据获取的3′-RACE和5′-RACE序列在非翻译区设计上、下游引物FaFL（5′-GCCATTGAAAG 　　AAGCGAGGAAG-3′）和FaRL（5′-TTAAGCACTTCTAGCTTCACCCTC-3′）验证拼接序列的真实性。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后回收目标片段，将其连接至pMD18-T载体[宝生物工程（大连）有限公司]，克隆FaRDL基因。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA测序由华大基因完成。 　　1.4 甜荞半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的序列和结构分析 　　将甜荞FaRDL基因开放阅读框（Open reading frame，ORF）编码的氨基酸序列进行BLAST比对。用MEGA5.0软件Clusta1W程序将FaRDL基因推导的氨基酸序列FaRDL（AFO83613）与NCBI中的同源蛋白序列GhCP（陆地棉Gossypium hirsutum，AER60490）、AdCP2（猕猴桃 Actinidia deliciosa，ABQ10200）、PvCP（菜豆Phaseolus vulgaris，CAB17074）、VsCP（野碗豆Vicia