聚丙烯酰胺凝胶电泳..ppt

* 聚丙烯酰胺凝胶电泳 作用 聚丙烯电泳是生物学科的1 项基本技术，被广泛运用到氨基酸、多肽、蛋白质( 活性蛋白或同工酶) 、核酸的分离和鉴定。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。 电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物 的 大小形状不同所致） 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） （根据亚基分子量分离蛋白质） （根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native） SDS的基本原理 1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS （十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS) 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。 SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。 连续电泳 不连续电泳 电荷效应 分子筛效应 PAGE 电荷效应 分子筛效应 浓缩效应：不连续性所致 电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性 不连续SDS原理 凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性 ① 凝胶的不连续性： 浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。 分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。 ② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性 操作步骤 制板 制分离胶 制浓缩胶 电泳槽安装 加样 电泳 剥胶 固定 染色 脱色 结果观察 *