实验三 单核苷酸多.pptVIP

实验五 单核苷酸多态性的检测 一 实验目的 1.了解SNP的概念，认识它在现代生物学中的科学意义及其它做为新型分子标记的应用。 2.了解SNP检测的技术及原理。 二.实验原理1.SNPs的概念 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNPs）是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。在一个群体中，当基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同核苷酸且出现频率大于1％（也有人提出2％）时，被视作SNP。由于这种界标数目极多，覆盖密度大，由此可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。 2.单核苷酸多态性检测与分析 SNPs的检测最初是应用凝胶电泳方法为基础的DNA测序，近来一些半自动或全自动识别和检测大量SNPs的方法正在发展起来。现用的实验方法有基于凝胶电泳的限制性片段长度多态性（RFLP）、等位基因特异的寡核苷酸杂交（ASO）、单链构象多态性（SSCP）分析、以荧光共振能量传递为基础的Taqman法和DNA芯片、质谱法、微测序法等。但由于这些方法价格昂贵以及本身的性能问题，所以目前还处于发展阶段，还未被临床广泛推广使用。 变性高效液相色谱(DHPLC)是近几年发展起来的高效、快速筛检SNP的技术，因其高灵敏度、低成本以及全自动化操作等优点而备受关注。 另外，环球基因公司(Transgenomics, Inc.)新开发的CEL1酶能识别单碱基错配，也被应用于SNP的检测。 变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC） 一种新的高通量筛选DNA序列变异的技术，其专利产品为WAVE DNA片段分析系统（WAVE DNA Fragment Analysis System）。其原理是用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链。该方法具有自动化、快速、检出率高、检出DNA片段大小范围广等优点。目前这项技术已用于基因序列的比较、人类基因多态性及疾病相关性的研究。 DHPLC进行基因突变检测的原理 DHPLC进行基因突变检测是基于异源双链的形成，一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突变型两种DNA，并且两者的比例为1：1，将PCR产物进行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，同样，当把野生型和突变型PCR产物混合后，进行变性复性过程，杂交后也会出现四种情况，它们不仅形成同源双链，同时也错配形成异源双链，异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离。 Figure 1 Creation of a mixture of hetero- and homoduplexes through hybridization  3. 本实验原理 本实验利用聚丙烯酰胺电泳，观察拟南芥不同生态型中某基因片段的SNP。根据测序结果，拟南芥不同生态型Ws和Col的At5g62130片段分子量大小相同，但存在单一位点的差异。用常规的琼脂糖凝胶电泳无法区分。 首先利用PCR扩增拟南芥At5g62130片段。对PCR产物进行变性和复性后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。由于SNPs的存在，Ws、Col 及Ws和Col杂交F1代中At5g62130扩增片段，因其构象不同，可根据其泳动速率的差异而区分。 Fig.?2? Typical band patterns of duplex analysis markers of different loci. Generation of co-dominant PCR-based markers by duplex analysis on high resolution gels The Plant Journal 1998, 16 ( 1): 117?  SNPs检测在分子遗传学中的应用Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) 四 实验步骤 1. 利用PCR扩增拟南芥基因At5g62130片段。 反应体系：引物（10μM）：各0.5μl; PCR buffer：2μl; dNTP (10μM): 0.5μl; Ta