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基因克隆分析
基因的克隆、转化与表达 相配末端(Compatible Ends) 同一种内切酶 平末端 EcoR V 和 Hinc II Bam HI 和Bgl II GGATCC AGATCT CCTAGG TCTAGA Sal I 和 Xho I GTCGAC CTCGAG CAGCTG GAGCTC Star activity: 在极端非标准条件下,限制性内切酶可以识别并切开与其特定序列相似但并不一样的序列。这种改变了特异性的特性被称为星活性。 BamHI BsiWI BsoBI DpnII EcoRI HgaI PflMI PvuII SalI ScaI SspI Tth111I High glycerol concentration [5% v/v] High units to μg of DNA ratio [Varies with each enzyme, usually 100 units/μg] Low ionic strength [25 mM] High pH [pH 8.0] Presence of organic solvents [DMSO, ethanol (5), ethylene glycol, dimethylacetamide, dimethylformamide, sulphalane (10)] Substitution of Mg++ with other divalent cations [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] 酶切反应体系 DNA 0.1 ug/ul 10XBuffer 1X DI-H2O Enzyme 3-5 unit/ug DNA Buffer 的选择 DNA聚合酶 DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment is a proteolytic product of E. coli DNA Polymerase I which retains polymerization and 3→ 5 exonuclease activity, but has lost 5→ 3 exonuclease activity. T4 DNA Polymerase: catalyzes the synthesis of DNA in the 5′→ 3′ direction has a 3′→ 5′ exonuclease activity which is much more active than that found in DNA Polymerase I. does not have a 5′→ 3′ exonuclease function. Fill-in of 5′ overhangs to form blunt ends Removal of 3′ overhangs to form blunt ends 基因表达 真核细胞:酵母、哺乳类细胞、昆虫 基因导入:磷酸钙沉淀、脂质体、电转 染、 病毒 表达检测:mRNA, 蛋白(定位,表达量) 功能研究: 原核细胞表达:细菌(宿主菌)、诱导、蛋白 分析(可容和包涵体)、纯化 复习思考题 DNA重组技术中常用的酶类有哪几种? 何谓星活性?影响因素都有哪些? 含有CMV启动子的质粒一般属于在原核细胞还是真核细胞表达的载体? * * DNA 重组技术(DNA recombinant techniques) 基因克隆(Gene Cloning) 工具酶 限制型内切酶(Restriction Enzymes) 磷酸酶(phosphatase) 激酶 (Kinase) 连接酶(Ligase) 目的片断 载体 限制-修饰体系——由限制性内切核酸酶与甲基化酶组成 限制性内切核酸酶 EcoRI 5’-G↓AATT C-3’ G AATTC 3’-C TTAA ↑ G-5’ CTTAA –5’ G Bam HI G GATC C 5’端粘性末端
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