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土霉素对蛋白核小球藻毒性效应研究 　　摘要：通过实验室条件下的培养实验，研究不同浓度的土霉素溶液对蛋白核小球藻的生长抑制作用以及对小球藻叶绿素含量的影响。结果表明，土霉素对蛋白核小球藻的生长具有抑制作用，且抑制程度随土霉素溶液浓度的增大而加强，半抑制浓度（IC50）范围为0.02～0.025(mg˙mL-1)。 　　关键词：蛋白核小球藻 土霉素 叶绿素 生长抑制 　　中图分类号：TQ465.1 文献标识码：A 文章编号： 　　1引言（Introduction） 　　抗生素由于对畜禽疾病的治疗及畜禽生长有促进作用，被广泛用作畜禽养殖业的饲料添加剂。而目前我国尚没有畜禽养殖业抗生素添加剂量的相关标准，导致土霉素常被过量使用甚至滥用。土霉素残存于环境中，对微生物活性及动植物生长具有毒害作用，并会对整个生态系统构成长期潜在危害，甚至会危及人类健康。土霉素是一种广谱抗菌药物，是四环素类抗生素的一种，黄色结晶性粉末，无臭微苦。熔点181～182℃（分解）。微溶于水，溶于乙醇、丙酮和乙二醇，不溶于氯仿和乙醚。在空气中稳定，遇强光颜色变深。本实验选用土霉素-盐酸制剂（土霉素浓度为50 mg˙mL-1)。 　　蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa）为绿藻门，小球藻属，普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8微米，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。在人工培养条件下能大量生长繁殖，产量很高。目前有关土霉素对蛋白核小球藻的毒性效应尚未见报道。本研究初步探讨了土霉素对蛋白核小球藻的生长抑制作用，为进一步研究抗生素进入水体后对水生微生物的影响提供科学依据。 　　2材料与方法（Materials and methods） 　　2.1材料 　　2.1.1材料与试剂：供试藻种为蛋白核小球藻（chlorella pyrenoidosa）购自中国科学院水生生物研究所；土霉素，90%丙酮等。 　　2.1.2 仪器与设备：RXZ型智能人工气候箱、紫外-可见光分光光度仪（Shimadzu UV-2401PC 日本岛津）、4 x 400 ml Thermo Scientific Sorvall ST 16离心机等。 　　2.2方法 　　2.2.1 培养 　　将蛋白核小球藻在无菌条件下接种至水生4号（HB-4）人工培养液中，用四层纱布封口放入RXZ型智能人工气候箱中，在24±1.0℃，光暗比12h:12h，3000-4000lux条件下恒温光照连续静置培养，定时摇动5-6次/d，以减少水藻细胞贴壁现象和保障对藻液光照均匀。培养至对数生长期，并进一步扩大培养。在藻液起始密度均为5.0×10^5个˙mL-1时根据预实验，按浓度梯度加入土霉素溶液，使藻液中的土霉素终浓度分别为0、0.01、0.011、0.013、0.016、0.02、0.025 mg˙mL-1用培养液定容至50mL。对照组设置2个平行，处理组设置3个平行。静置培养，每隔24h测定一次吸光度，连续测定96h。 　　2.2.2 测定 　　1）藻液吸光度的测定 　　在0、24、48、72和96h分别用紫外-可见光分光光度仪（Shimadzu UV-2401PC 日本岛津）测定藻液在680nm波长下的吸光度,根据测得的藻液吸光度计算土霉素对小球藻的生长抑制率，得出相应的IC50。 　　土霉素对小球藻的生长抑制率的计算： 　　本实验以生物量为依据进行计算，生长抑制率(IC)计算公式如式(1)所示. 　　Iy =(Yc-Yt) / Yc(1) 　　式中： 　　Iy为以生长量为基础的抑制率，%； 　　Yc为对照组各平行生长量的平均值； 　　Yt为处理组各平行的生长量； 　　2）叶绿素含量的测定 　　蛋白核小球藻在土霉素的影响下培养96h后，将各组藻液分别经微孔滤膜（0.45μm）过滤（过滤后若不及时测定则低温-20℃保存，可保存约3个月），并分别存放到编号为0、0.01、0.011、0.013、0.016、0.02、0.025的小样品管中。将滤膜置于研钵，加入适量的碳酸镁、石英砂和适量90%丙酮，研磨至足够细（使得小球藻的叶绿素尽可能溶解到丙酮中，观察到的现象为上层浅绿色，下层白色或接近白色），移入10ml具塞刻度试管，并加90%丙酮溶液定容至ml刻度，于暗处4℃静置萃取24h。用离心机离心得上清液，将上清液分别移入10ml具塞比色管中，用丙酮定容到10ml刻度线。用分光光度仪分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算叶绿素a和叶绿素b的浓度以及总叶绿素浓度。 　　 Ca=12.7A663-2.69A645Cb=22.9A645-4.68