右归丸干预自身免疫性POF小鼠Treg和Foxp3基因表达研究.docVIP

右归丸干预自身免疫性POF小鼠Treg和Foxp3基因表达研究 　　【摘要】目的：观察卵巢早衰模型小鼠卵巢组织内Treg和Foxp3基因表达水平的变化及右归丸的干预作用。方法：采用透明多肽建立小鼠自身免疫性卵巢早衰模型。RT-PCR法检测卵巢组织Treg和Foxp3基因表达水平。结果：模型组Treg和Foxp3基因表达水平均明显下降，与正常组相比有显著差异性（p0.05）；西药组Treg和Foxp3基因表达水平与模型组比较无统计学意义（p0.05）。结论：卵巢早衰的组织损伤可能与Treg和Foxp3基因表达水平下降对自身免疫反应的抑制降低导致，而右归丸可通过上调Treg和Foxp3基因表达水平来诱导自身免疫耐受和抑制自身免疫性卵巢损伤。 　　【关键词】右归丸；卵巢早衰；调节性T细胞；叉头状蛋白3 　　【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）11-210-03 　　卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指性器官发育正常的女性在40岁以前出现闭经，伴卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素（estradiol， E2）水平降低，卵泡数量减少，卵巢体积缩小并最终萎缩的卵巢功能衰退现象。发病率约为1%～3%。大约10%～30%的POF是由于免疫系统不能识别自身卵巢组织所致，该类患者常合并多种自身免疫性疾病。自身免疫性POF可能与Treg细胞数目减少有关。中医认为肾虚，肾的阴阳平衡失调是POF的根本病机。右归丸作为补肾中药中“阴中求阳”代表方，临床证实该方治疗不孕症、更年期综合征、骨质疏松疗效显著[1]。本实验采用RT-PCR法观察卵巢早衰模型小鼠卵巢组织内Treg和Foxp3基因表达水平的变化，并予右归丸治疗，观察右归丸对卵巢早衰模型小鼠Treg和Foxp3基因表达水平的影响。 　　1材料 　　1.1实验动物： SPF级BALB/c雌性小鼠72只，1月龄，体重18～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，中国科学院上海实验动物中心检验。许可证号为CXK（湘）2009-0004。雌雄小鼠按6：1比例同笼隔开饲养以诱导正常动情周期。 　　1.2药物与主要试剂 　　1.2.1小鼠透明带3多肽片段（pZP3），为透明带3的第330-342个氨基酸，其序列为：Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Gln-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg，经过HPLC分析纯度90%，购自杭州中胎生化有限公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，均购自美国Sigma公司。 　　1.2.2右归丸中药饮片由湖南中医药大学第一附属医院提供，交由湖南中医药大学药学院生物工程实验室制成中药水提纯液；戊酸雌二醇片（补佳乐片）规格为1mg/片，由湖南中医药大学第一附属医院提供，DELPHARM Lille S.A.S公司生产，国药准字号：产品批号：202A；醋酸甲羟孕酮片（安宫黄体酮片）规格为2mg/片，由湖南中医药大学第一附属医院提供，浙江仙琚制药股份有限公司生产，国药准字号：批号：100913。 　　1.2.3一步法RT-PCR试剂盒（宝生物工程有限公司）；Trioz（国药集团化学试剂有限公司）；100bp标准DNA分子量（美国Pormega公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（国药集团化学试剂有限公司）引物合成：由上海生工生物工程公司合成。（Treg引物：上游：5’-AAGTAGAAGAGGGCAACC-3，下游：5’-GGTCTGCTGACCTCCTTGTG-3；FOXP3引物：上游：5’-TACCACTGGTTCACACGCATGT-3’，下游：5’-CACCCGCACAAAGCACTTG-3’；内参β-actin引物：上游：5’--ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3’，下游：5’-ATTGTAACCAACTGGGACG-3。） 　　1.3主要仪器： 金诺天平仪器有限公司的电子天平；Derby低温冰箱；美国Thermo公司紫外分光光度仪；美国Thermo公司DNA热循环扩增仪；美国Startganee公司凝胶扫描成像分析系统；麦克奥迪实业集团公司Mot1cBS显微摄像系统；美国ThermoPxZ型PCR仪；北京六一公司电泳仪等。 　　2方法 　　2.1 POF模型建立： 将购得的1月龄小鼠常规喂养1W适应新环境后进行造模。小鼠自身免疫性POF模型建立参照文献方法[2]：称取4mg ZP3透明带多肽粉末，加入4mL三蒸水配成溶液，取2mL溶液稀释至12mL溶液，与弗氏完全佐剂按1：1比例配