动物细胞培养、计数、冷冻与复苏实验.docVIP

动物细胞培养、计数、冷冻和复苏 实验报告 由于本次实验分三天进行，日期分别为10月31日（周一）、11月2日（周三）、11月4日（周五），实验内容分别为动物细胞培养、结束，动物细胞冷冻以及最后的动物细胞的复苏，又因为冷冻和复苏可视为连续环节，故本报告分成两个部分来记录本次实验，具体内容如下： I. 动物细胞的培养和计数 实验目的 由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。 本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。 基本原理 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。 体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。 体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。 动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。 动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。 细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为： 四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。 细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为： 活细胞数÷总细胞数×100％。 仪器、材料和试剂 超净工作台 倒置显微镜 二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为5％。 培养基：DMEM培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22μm滤膜除菌过滤。 血清：Hyclone新生小牛血清。 PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。 胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25％，0.22μm滤膜除菌过滤。 玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。 血球计数板 移液枪 台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用。 实验步骤 贴附型细胞传代培养 倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基； 用10ml无菌PBS洗涤，倒掉； 加入2ml胰酶溶液（0.25％），进行消化； 显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形； 倒掉胰酶； 按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。 悬浮细胞传代培养 按贴附型细胞传代培养步骤（6）操作即可。 细胞计数 将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙； 待计数样品如果需要，用PBS进行稀释； 取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液（0.4％），用滴管轻轻吹打混合； 用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球