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探讨干预小鼠急性酒精性肝损伤细胞凋亡时间窗 　　DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.04.009 　　作者单位：100050 北京，首都医科大学北京友谊医院急诊科 　　通信作者：杨立沛，Email： ylp8499@139.com 　　【摘要】目的 建立小鼠急性酒精性肝损伤的模型，通过测定肝脏组织内的相关增殖凋亡蛋白的变化，探讨抑制其细胞凋亡的治疗时间窗，以指导临床治疗肝损伤。方法 将30只雄性KM种小鼠饲养于首都医科大学清洁级动物房，随机分为两组（随机数字法）。对照组10只给予正常喂养，实验组20只，一次性给予50%乙醇（12 mL/kg）灌胃，分别在灌胃6 h（m 6 h）和12 h（m12 h）两个时间点处死小鼠各10只。苏木素-伊红（HE）染色法观察小鼠肝脏组织病理学的变化。应用Western-blot的方法监测小鼠肝脏中蛋白T-ERK，P-ERK，PKC，P-PKC，caspase-3的含量变化。用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，进行方差分析，以P 　　【Key words】Mice； Acute alcoholic liver injury； Apoptosis；Proliferation； T-ERK；P-ERK；PKC；P-PKC；caspase-3 　　在欧美国家中， 酒精性肝病（alcoholic liver disease， ALD）的患病率高达84%， 其中20%～30%的酒精性肝病可进展为肝硬化[1-2]。随着我国生活水平的提高，酒精消费量的日益增长， ALD的发病率也呈现逐年升高的趋势。目前，建立急性酒精性肝损伤的动物模型，并在动物模型上寻找干预急性酒精性肝损伤细胞凋亡的有效时间点，从而指导临床及时干预肝损伤，成为国内外研究的重点。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组 　　健康KM种雄性小鼠30只，体质量为18～22 g，由首都医科大学实验动物部提供，饲养于首都医科大学清洁级动物房，12 h光照和黑夜循环， 温度（22±2）℃，相对 湿度50%～60%，标准饲料，自由饮水。经过7 d适应性喂养后，随机（随机数字法）分成2组，即对照组（10只）、实验组（20只）。实验地点是首都医科大学北京友谊医院中心实验室。 　　1.2 材料与试剂 　　ERK（#5013），P-ERK（#4370），PKC（#2056），P-PKC（#9375），caspase-3（#9662）以及β-actin（#4967）抗体均购自美国cell signal technology公司，二抗购自中杉金桥。其他为国产分析纯。 　　1.3 仪器 　　ASP300自动脱水机（LEICA，德国）；EG 1160自动包埋机（LEICA，德国）；RM2235石蜡切片机（LEICA，德国）；酶标仪（Biorad，美国）。 　　1.4 模型制备 　　小鼠经适应性喂养后，禁食12 h，实验组用体积分数为50%的乙醇（分析纯，以蒸馏水稀释）造成肝损伤模型，灌胃量12 mL/kg，灌胃后禁食，灌胃后小鼠出现爬行不稳、后腹拖地、闭眼懒动等醉酒指标[3]，在实验过程中各组小鼠均无死亡。于灌胃后6 h和12 h处死动物，在小鼠肝脏固定部位取材，一部分置于福尔马林中，一部分迅速液氮保存，用于形态学及分子生物学的研究。 　　1.5 实验方法 　　1.5.1 HE染色 置入福尔马林中固定的小鼠肝脏组织，经脱水处理后包埋入石蜡，并切成4 μm厚度的连续切片，黏附与载玻片上。经烤片，脱蜡，蒸馏水洗，苏木素染核，水洗，分化，伊红浸泡，水洗，脱水透明，中性树脂封片。镜下观察。 　　1.5.2 Western Blot检测及其分析 取肝组织匀浆，离心后取裂解液上清，BCA法蛋白定量测定蛋白浓度。取100 trg蛋白于10%SDS电泳后，转至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL试剂（pierce）检测阳性信号。以β-actin表达水平作为内参。 　　1.5.3 统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，并用SPSS 11.5统计软件进行方差分析，以P0.05；（1.30±0.25）， （1.47±0.27），P0.05]，而m12 h组中P-ERK含量与对照组比较差异具有统计学意义[F=4.82，（0.97±0.25）， （2.41±0.38），P0.05；（0.10±0.01），（ 0.14±0.02），P0.05]；而m12 h组中P-PKC的含量与对照组比较差异具有统计学意义[F=29.36，（0.08±0.01），（0.16±0.00） ，P[4-5]，近几年细胞凋亡机制与酒精的肝损伤的关系已被确定[6-7]。目前