血府逐瘀汤及拆方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用.docVIP

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血府逐瘀汤及拆方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用

血府逐瘀汤及拆方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用   【中图分类号】R285【文献标识码】A【文章编号】1004-7484(2012)14-0237-02   脑血管病是一种严重危害人类健康的疾病,脑血管病在中国为第一位致死原因,而缺血性脑卒中占脑血管病的大部分。血府逐瘀汤出自清代医家王清仁的《医林改错》,作为血瘀症的经典方,血府逐瘀汤具有活血化瘀而不伤血舒肝解郁而不耗气的特点,已广泛应用于治疗脑血管疾病,并且取得了较好的疗效。但对于其机制的研究尚不多见。本实验旨在研究血府逐瘀汤及其拆方对大鼠局灶性缺血再灌注损伤后的作用及其机制。   1 材料和方法   1.1 动物实验、试剂及仪器   健康成年SPF级SD大鼠50只,雌雄各半,体质量(250±30)g。由浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心提供。血府逐瘀组(桃仁、红花、川芎、赤芍、柴胡、枳壳、当归、生地、甘草、桔梗、牛膝)、精制血府逐瘀组(桃仁、红花、川芎、赤芍、柴胡、枳壳)和药对组(赤芍、柴胡)由浙江大学医学院附属第一医院中药房提供。将药材加水煎成200%浓度(即1ml相当于2g生药)。   1.2 动物分组、模型制备与给药   50只健康成年SD大鼠随机分为假手术组、模型组、血府逐瘀组、精制血府逐瘀组和药对组,每组10只。假手术组、模型组每日生理盐水2.5ml/kg灌胃,每日2次,血府逐瘀组、精制血府逐瘀组和药对组给予相应的方剂煎制成2g/ml生药汤剂,以5g/kg生药给药量灌胃,每日2次。7天后参照Zea Longa方法加以改良制作。大鼠经10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g),麻醉后仰卧固定于手术台上,颈正中去毛,复合碘消毒后纵向切开颈部正中皮肤及皮下组织,分离暴露并结扎左颈总外动脉,保持颈外动脉及翼颚动脉通畅,微动脉夹夹闭颈内动脉近心端,自颈总动脉远心端插入0-3号尼龙线(头端浸蜡成长径2-3 mm的椭圆球形),直视下自颈动脉分叉处插入19-20 mm,即可导致左侧大脑中动脉栓塞,线栓保持60 min后,撤除并关闭切口,术后加强营养支持,连续5天腹腔注射青霉素钠4万单位抗感染。假手术组不插入尼龙线,余步骤相同。以大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪, 站立不稳, 提尾时向一侧转圈为模型成功的判断标准。   1.3 神经功能评分   再灌注24 h后观察大鼠神经功能缺失状态,参照Zea Longa评分标准进行评定。0分:无神经损伤症状;1分:对侧前爪不能完全伸直;2分:行走时向对侧转;3分:站立不稳,向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。0 分、4 分或死亡剔除, 再随机补充并进行上述手术操作过程。比较各组神经功能评分。   1.4 标本制备   神经功能评分后,给予乙醚麻醉,开胸,左心室插管至主动脉,剪开右心耳放血,以生理盐水120 mL快速灌流,至右心耳流出无色透明液体,再以4%多聚甲醛灌注固定,开颅取脑,置于4%多聚甲醛液固定24 h。在视交叉前后切开,前后各取4 mm厚脑组织片,常规制备脑组织石蜡切片,厚度约5μm。   1.5 标本检测   采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,根据试剂盒说明书完成,在光镜下计数缺血侧海马区不重复视野凋亡细胞数,比较各组凋亡细胞的变化。应用免疫组化法检测Bcl-2和Caspase-3,DAB显色,比较各组Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达情况。   1.6 统计学处理   应用SPSS11.0统计软件,数据用均数±标准差表示,行单因素方差分析ANOVA。P   对缺血性脑血管疾病的研究发现,脑血管闭塞后,处于严重缺血状态的中心区很快发生神经细胞的坏死,边缘半暗带缺血区出现神经细胞的凋亡,而细胞凋亡的发生可能是梗死灶扩大的关键。凋亡是由细胞内外环境变化或死亡信号触发,受内源性基因、酶类和信号传导途径等调控的细胞主动死亡过程。此过程中可引起抗凋亡和促凋亡有关蛋白如B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白等的表达改变,这些蛋白的表达水平决定了神经元是生存或凋亡[5]。Bcl-2蛋白是目前已知的重要抑制凋亡蛋白。有研究表明,Bcl-2蛋白通过细胞凋亡早期环节而发挥作用,可阻断降解细胞皱缩,染色质浓缩和DNA裂解的发生,过度表达后可抑制由于钙超载、氧自由基、兴奋性氨基酸等所致的神经细胞凋亡[6-7]。Caspase-3是Caspase级联瀑布下游最关键的凋亡蛋白酶,在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用,其作用于胞质中的骨架蛋白或细胞核中的DNA酶,引起DNA断裂,而引发细胞凋亡[8]。   总之,本研究发现在脑缺血再灌注后,血府逐瘀汤及拆方能特异性增加Bcl-2蛋白表达,抑制Caspase-3的激活,对于防止脑缺血迟发性神经元

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