降钙素基因相关肽对大鼠主动脉平滑肌细胞HRG―1和SM22影响.docVIP

降钙素基因相关肽对大鼠主动脉平滑肌细胞HRG―1和SM22影响 　　【摘要】目的研究降钙素基因相关肽（CGRP）对大鼠主动脉平滑肌细胞中高血压相关基因（HRG-1）和平滑肌22?（SM22?）表达的影响，为阐明CGRP抑制主动脉平滑肌细胞增殖以及表型转化的机制提供实验依据。方法取健康SD大鼠的主动脉，按照器官培养方法行体外培养血管，HE染色和抗5-Brdu免疫细胞化学染色观察细胞增殖情况，实时定量RT-PCR检测血管平滑肌细胞增殖相关基因HRG-1和表型转化相关基因SM22?的表达水平，统计分析加CGRP组和未加CGRP组基因表达水平的差异。结果CGRP组增生斑块明显较外源脂质组减少，外源脂质组的血管中膜可见大量被标记的增生平滑肌细胞，CGRP组标记到的增殖细胞明显减少；CGRP组较外源脂质组HRG-1和SM22?表达明显增高。结论CGRP对血管平滑肌增殖的抑制作用与上调增殖负性调控基因HRG-1和收缩表型标志基因SM22α的表达有关。 　　【关键词】器官模型；平滑肌增殖；降钙素基因相关肽；表型转化；高血压相关基因；平滑肌22α 　　doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.583文章编号：1004-7484（2013）-07-3983-02 　　降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一种由37个氨基酸组成的另一种血管活性肽。动物实验表明动脉粥样硬化兔血清中的CGRP明显降低。细胞培养证实，CGRP对人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用，并推断其作用机制是通过抑制周期蛋白D、E。使VSMC停留于G0/G1期，限制细胞周期进程而达到抑制VSMC增殖[1-3]。然而，CGRP对VSMC表型转化的影响如何还未见报道。本实验通过建立血管平滑肌细胞增殖的器官模型，以CGRP为干预因素，研究CGRP对大鼠主动脉平滑肌细胞中HRG-1和SM22?表达的影响。 　　1材料与方法 　　1.1动物150g-200g健康SPF级SD大鼠。 　　1.2主要试剂及仪器CGRP；噻唑蓝（MTT）；兔抗大鼠HRG-1抗体、兔抗大鼠SM22?抗体；山羊抗兔二抗购于武汉博士德公司；标准胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司BCA蛋白定量试剂盒购于美国HyClone公司。 　　1.3实验方法 　　1.3.1大鼠主动脉血管平滑肌增殖器官模型的建立和实验分组选用体重150g-200g健康大鼠12只，腹腔注射浓度为3.6%的水合氯醛（1ml/100g），取大鼠腹主动脉，用Hanks液冲洗三遍，取出血管周围多余脂肪组织，剪成2.5cm左右小段，随机分成3组：A、B、C，每组两段血管。A组用含有CGRP（终浓度为2×10-7mol/L）和ox-LDL（终浓度50μg/ml）的培养液培养，B组用含有ox-LDL（终浓度50μg/ml）的培养液培养；C组用新取出大鼠主动脉，不予培养。以上步骤所制备材料供H-E染色和抗5-Brdu免疫细胞化学染色所用。 　　1.3.2细胞增殖情况的测定H-E染色和Brdu标记的免疫组织化学观察细胞增殖情况。每一批免疫组化均设已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。5-Brdu阳性表达定位于细胞核。评分标准：全部阴性细胞为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%-50%为2分；51%-75%为3分；75%为4分。染色强度：0分为无染色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为深棕色。免疫组化结果根据染色阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积0-1分为阴性（-）；2-3分为阳性（+）；4分以上为强阳性（++）。 　　1.3.3Real Time RT-PCR检测目的基因取材方法及培养方法同上。称重（约50mg）后将其剪成小块，放入预冷的研钵内快速研磨、匀浆，直至匀浆液变成无颗粒透明液体。进行总RNA提取、纯度和完整性检测。参照说明书进行逆转录反应，反应结束后，实验数据用系统自带的SDS软件（v1.4）进行分析。相对定量实验使用的分析方法为比较Ct值法。Ct值表示阈值循环，是荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。根据公式：△△Ct=[目的基因-内参基因]实验组样品-[参照样品基因-内参基因]对照组样品，本文实验采用△Ct最大的样品组为参照组。计算实验组样品相对于对照组基因的表达量2-△△Ct。 　　1.4统计学处理实验数据均以均数±标准差（χ±s）表示。实验数据资料统计采用统计学软件SPSS for Windows 13.0。两组间比较用独立样本t检验。P0.05差异无统计学意义。 　　2结果 　　2.1HE染色和免疫组化观察血管壁平滑肌细胞的增殖情况正常对照的未予培养组（C组）管壁未见增厚，其余各组均见管壁增厚，其中加了CGRP的