髓复康对大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白及其受体表达影响.docVIP

髓复康对大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白及其受体表达影响 　　摘要：目的 观察益气活血补肾方髓复康对大鼠脑缺血损伤区勿动蛋白（Nogo）-A及其受体（NgR）表达的抑制作用。方法 除正常组外，采用Koizumi法制作SD大鼠单侧大脑中动脉阻塞模型（MACO），并随机分为模型组、阳性对照组及髓复康大、中、小剂量组，各组在给药8、15、30 d 3个时间点取大鼠脑组织，采用免疫组化方法检测各组脑缺血损伤区Nogo-A及NgR表达量的差异。结果 髓复康大、中、小剂量组Nogo-A、NgR表达减弱，与模型组比较差异有统计学意义（P 　　关键词：髓复康；脑缺血损伤；勿动蛋白；勿动蛋白受体；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.011 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0028-03 　　基金项目：国家自然科学基金 　　通讯作者：郑格林，E-mail：zhenggelin@163.com 　　中枢神经系统（CNS）损伤后的再生修复一直是困扰医学界的难题。勿动蛋白（Nogo）-A是目前发现的最为强烈的神经纤维再生抑制物质，抑制损伤神经发生，尤其是再生神经纤维的 　　长距离生长[1-2]，Nogo受体（NgR）是一种糖基醇磷脂结合蛋白，是Nogo的一种功能性细胞表面受体，研究表明其在提高CNS再生能力的治疗方面有显著作用[3]。我们在前期实验研究中发现，不管是在在体实验还是在离体细胞培养中髓复康都可以促进损伤神经元轴突的再生[4]。本实验采用免疫组织化学染色的方法，从整体动物蛋白水平，观察髓复康对脑损伤大鼠神经元轴突再生抑制因子Nogo-A及NgR表达的影响，探讨髓复康促进损伤神经元轴突再生过程中Nogo-A及NgR的作用机制，为中药治疗脑缺血损伤修复提供一定的实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　成年雄性SD大鼠144只，体质量220～240 g，清洁级，购自维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2007-0001。 　　1.2 药物 　　髓复康，主要成分为黄芪、葛根、三七、川芎等，中国中医科学院望京医院药房制剂室制备煎剂，浓度为2.5 g/mL，置于4 ℃冰箱中备用。注射用甲基强地松龙，大连辉瑞制药有限公司，规格40 mg/支，批号040112。 　　1.3 试剂 　　乙醇、二甲苯，北京化学试剂公司，批20100312；哈瑞氏苏木素染液，天合力恩试剂公司，批Nogo-A一抗，英国abcam公司，批号667209；NgR一抗，英国abcam公司，批号820262。 　　1.4 仪器 　　EG1150H包埋机（德国LEICA公司），RM2235切片机（德国LEICA公司），HI1210摊片机（德国LEICA公司），BX51显微镜（日本OLYMPUS公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 分组与造模 　　将144只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组及髓复康大、中、小剂量组，每组24只。各组根据给药时间不同，分为8、15、30 d 3个亚组，每个亚组8只大鼠。除正常组外，参照Koizumi法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型（MACO），从颈总动脉分叉处插入4-0丝线，沿颈内动脉进入距离颈总动脉分叉处约2.0 cm处停止，1 h后拔出丝线再灌注。 　　2.2 给药与取材 　　待动物清醒后，髓复康治疗组逐日灌胃髓复康煎剂，髓复康大、中、小剂量组灌胃原药材剂量分别为每次5、2.5、1.25 g/100 g；阳性对照组术后腹腔注射甲基强地松龙，剂量为每次30 mg/kg，隔日1次；模型组灌胃等量生理盐水；正常组同期喂养不做任何处置。各组每3 d称重1次，重新计算每只动物药量，直至取材时。各亚组在相应的取材时间点用0.4%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，4%多聚甲醛（pH值7.2～7.4）经心脏主动脉插管灌注处死动物。取全脑，制备病理切片。 　　2.3 大鼠脑缺血损伤区勿动蛋白-A及其受体表达检测 　　制备全脑病理切片后，进行前期脱腊处理：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→放入蒸馏水；PBS 5 min×3次；3%H2O2作用；进行抗原修复；加入一抗，37 ℃孵育作用2 h；PBS 5 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育作用1 h；PBS 5 min×3次；进行DAB显色；最后进行苏木素复染，封片。免疫组化染色后，通过图像分析软件MIA 4.0半定量分析Nogo-A和NgR的表达量。 　　3 统计学方法 　　采用SPSS11.0软件分析，所