聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯磁性纳米凝胶基因转染性能研究.docVIP

聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯磁性纳米凝胶基因转染性能研究 　　摘 要：本文以聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯-磁性纳米凝胶作为作为转基因载体，考察了其对细胞的毒性作用及期基因转染的性能，为磁性纳米凝胶在生物医学领域的应有提供了一条新途径。 　　关键词：磁性纳米凝胶 聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯 转基因载体 安全性评价 　　将外源基因导入真核细胞的方法大体可分为两大类：病毒感染法和非病毒转染法。病毒载体效率高，是目前基因治疗的主要手段，但病毒载体存在携带基因长度有限、可能引起免疫反应与细胞毒性等问题[1]。由于磁性纳米颗粒具有较好的生物相容性、磁靶向性等优势，非病毒载体在靶向药物、磁共振成像等领域获得较广泛的应用[2]。研究发现，磁性纳米颗粒能给携带外源DNA进入细胞，可作为一种新的转基因载体应用于外源基因的导入[3]。在前期制备了聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（PDEA）磁性纳米凝胶的基础上，我们考察了该纳米凝胶对细胞的毒性作用，并以常用的两种质粒（pEGFP-N1、pRL-TK）考察PDEA-磁性纳米凝胶作为转基因载体的应用情况。 　　一、实验部分 　　1.PDEA-磁性纳米凝胶对pRL-TK质粒的吸附及保护研究 　　取5μg pRL-TK质粒于干净离心管中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，再加入适量TE缓冲液至终体积为20μL，置入摇床孵育10min。取5μL加样进行琼脂糖凝胶电泳（1%），进行EB染色，考察PDEA-磁性纳米凝胶结合质粒DNA情况。取 100 μL 磁性纳米凝胶-DNA复合物（含PDEA-磁性纳米凝胶1.0mg， DNA 25μg），加入Deoxyribonuclease I （DNase I）（1 U/μg of DNA），37℃孵育2h，反应完毕，加入6 μL 乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic acid， EDTA） 溶液（0.25M， pH 8.0）灭活DNase I，然后向溶液中加入12 μL 十二烷基磺酸纳（sodium dodecyl sulfate， SDS， 15%）溶液，孵育10 min，然后，向纳米颗粒中加入20μL 7%的肝素（heparin）溶液，孵育1h，使未被降解的DNA从PDEA-磁性纳米凝胶表面解离下来。将混合溶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，以考察质粒DNA被DNase降解情况。 　　2.细胞毒性及基因转染研究 　　HepG2细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度的空气中培养，培养液选用1640，其中含有10%的牛血清（FBS），5%的双抗（青-链霉素）。 　　应用胰酶将HepG2细胞消化，加入适量新鲜1640培养液，调整细胞密度为1×105 cell/ml，取细胞悬液铺96孔板（200μL/孔），至细胞融合度80～90%时，吸弃细胞培养液，并立即加入200μL含不同PDEA-磁性纳米凝胶的新鲜1640培养液，继续培养不同时间后，加入0.5%的MTT，37℃培养4h。终止培养，小心吸弃孔内培养液，加入150 μL DMSO，置摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，应用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。 　　取0.2 μg 质粒pEGFP-N1于200 μL 无血清1640培养液中，加入5μg PDEA-磁性纳米凝胶，轻轻混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，使质粒充分吸附在PDEA-磁性纳米凝胶表面。将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养，24h后，小心弃去培养液，加PBS清洗一次，将未进入细胞的纳米颗粒清洗掉，再加入200新鲜的1640培养液，应用倒置相差（荧光）显微镜观察荧光蛋白的表达情况。 　　取0.2 μg 质粒pRL-TK于200 μL无血清1640培养液中，加入不同量的PDEA-磁性纳米凝胶，混匀，得到转染混合物，室温静置孵育10 min，将转染混合物加入各孔细胞内，37 ℃孵育，1 h后加入1 mL含10%牛血清的培养液，继续培养24h。以预冷的PBS洗涤细胞，加入100μl细胞裂解液PLB（Passive lysis buffer），温和摇动15min，使细胞被动裂解。将20μl细胞裂解液与100μl StopGloTM试剂混合，激活pRL-TK中的Renilla（海肾）萤光素酶，并立即检测萤光素酶的活力。 　　二、结果与讨论 　　1.质粒DNA在PDEA-磁性纳米凝胶表面的吸附及保护作用 　　由于PDEA修饰在磁性纳米颗粒表面，使纳米颗粒表面带有正电荷，从而可以结合质粒DNA。如果质粒DNA结合在PDEA-磁性纳米凝胶表面后，由于磁纳米颗粒比较大，从而改变质粒DNA在琼脂糖中的电泳图谱[4]。由图1 可以看出，当5μg质粒DNA与80μg P