细胞培养分析.ppt

冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用 漂漬液的应用（本实验用方法） 冲洗： 初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 漂漬液浸泡: 漂漬液浓度：1：40～50（漂漬液：蒸馏水） 浸泡24小时 溶液如变黄需更换（约一个月） 清洗： 用自来水，蒸馏水清洗干净后，烘干，高压消毒 胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用 塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用 本实验： 自来水洗→蒸馏水洗→甩干水→干燥→ 装盒→消毒。 消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，30min 干烤：160℃, 2 小时 过滤：0.22μm 化学消毒灭菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染 营养需求 细胞培养基应用选择 参考： (1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、 DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等 制备1000ml RPMI?1640培养基 RPMI?1640?干粉培养基10.4g（1包） 三蒸馏水?400ml 　　　↓　 磁力搅拌至完全溶解? 　　　↓　 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22μm 孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20℃保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。 ------- 细胞培养液 消化液 分离组织和分散细胞 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 单独或混合使用 胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液（常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%））搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效）， 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调 pH 至7.2 左右 胰蛋白酶溶液配制 D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g EDTA·4Na 溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02