北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6表达分析及其原核表达.docVIP

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6表达分析及其原核表达 　　[摘要]该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平。BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异，但均高于茎中的转录水平。BcUGT6在叶中转录水平最高，在花中最低。以未处理的为对照，BcUGT6在MeJA处理后2 h，8 h，24 h，2 d，4 d的北柴胡不定根中，转录水平均提高近2倍，表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小。BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加，4 d时，达7倍左右。利用载体pET-28a （+），进行了2个基因的原核表达。IPTG诱导后，宿主菌表达出了目的蛋白，并获得了纯化蛋白。为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础。 　　[关键词]北柴胡；UGT基因；组织表达；MeJA诱导表达；原核表达；蛋白纯化 　　[收稿日期]2013-07-09 　　[基金项目]国家自然科学基金面上项目 ；北京市自然科学基金面上项目（5102033）；中医药行业科研专项（201107011） 　　[通信作者]*隋春， Tel/Fax： （010 E-mail：csui@北柴胡Bupleurum chinense DC.是药典规定的生药柴胡基原植物。药理学研究表明柴胡皂苷是柴胡抗炎、解热、抗流感病毒等作用的主要药效成份[1]。柴胡皂苷单体主要为齐墩果烷型三萜皂苷，属于柴胡植物次生代谢形成的天然产物。目前已知植物合成的天然产物超过20万种，其中绝大部分以糖基化形式存在[2-3]。皂苷是天然产物中的一大类，研究其糖基化机制，具有重要意义。糖基化过程由植物体中超基因家族编码的糖基转移酶催化。植物体内糖基转移酶基因数目多，涉及代谢途径复杂多样。近来，测序技术尤其是高通量测序技术的广泛应用，促进了多基因家族的挖掘和研究。人参、三七、甘草等药用植物以及合成皂苷成分的主要农作物，大豆、苜蓿等的皂苷生物合成与调控研究取得进展[4-8]。通过序列分析，获得了可能参与皂苷生物合成的酶基因，仍有待进一步的功能分析[9-10]。前期利用测序技术和RACE方法获得了北柴胡7个UGT全长cDNA序列，这些全长序列编码的蛋白与已报道UGT的进化树分析表明，其中BcUGT3 （GenBank：JF803819）编码蛋白与已鉴定参与皂苷合成的GmSGT2 （AB473730）和MtGT3 （FJ477891），BcUGT6 （JF803822） 编码蛋白与可能参与三萜及单萜类化合物合成的AsUGT709A10 （EU496501）和CsUGT4 （GQ221689）关系较近[11]。为进一步分析BcUGT3和BcUGT6基因是否参与柴胡皂苷生物合成，本研究对这2个基因进行了组织表达和MeJA诱导表达特性分析，构建了原核表达载体，诱导表达后纯化了目标蛋白，为深入开展基因功能研究奠定了基础。 　　1材料与仪器 　　北柴胡B. chinense品种“中柴1号”不定根材料为实验室先前培养和MeJA处理，于液氮中速冻后保存于-80 ℃[12]。取处理后2 h，8 h，24 h，2 d，4 d的不定根，同时每个时间点设置不经MeJA处理培养的不定根为对照。分别取一年生“中柴1号”二级花序盛花期、一级花序果期时的根、茎、叶、花、果实，于液氮中速冻后保存于-80 ℃。 　　宿主菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL和Rosetta-gami B（DE3）plysS（中国质粒载体菌株基因库）。T载体（pEASY-Blunt Zero，北京全式金生物技术有限公司）。RNA纯化试剂盒（Norgen， Canada）。PrimeScript RT reagent kit，SYBR PrimeScriptRT-PCR kit Ⅱ（Perfect Real Time）试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。2×PCR Solution PrimeSTARTM HS Premix（宝生物工程（大连）有限公司）。SDS凝胶制备试剂盒，SDS上样缓冲液（还原，5×），ProteinShow-G250蛋白快速染色试剂，一步快速法Western blot试剂盒，抗His-tag鼠单克隆抗体和高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪公司）。PrepEase His标签蛋白纯化试剂盒（德国USB公司产品）。NanoDrop ND 2000，ChemiDoc XRS凝胶成像分析系统、PCR仪iCycler iQ5，BioPhotometer核酸蛋白质分析仪、琼脂糖水平电泳槽、半干转印仪和高压电泳仪（美国Bio-Rad）。 　　2方法 　　2.1RNA提取利用RNA纯化试剂